閔亞林，姜思羽，吳迪生，陳文雙，許碧蓮,

(廣東醫(yī)科大學(xué)1. 藥理學(xué)教研室、2. 廣東天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 湛江 524023)

骨性關(guān)節(jié)炎(osteoarthritis, OA)是由創(chuàng)傷、肥胖、衰老、遺傳等許多因素引起的關(guān)節(jié)軟骨損傷退化、軟骨下骨及關(guān)節(jié)增生的一種退行性病變[1]。據(jù)統(tǒng)計(jì)報(bào)道，肥胖和人口老齡化常常伴隨著OA的產(chǎn)生，男性的患病率往往低于女性，OA影響著越來(lái)越多的人[2]。據(jù)預(yù)測(cè)，到2020年，OA將是40歲人群發(fā)病和身體局限的主要原因。如何防治OA，是人們亟待解決的難題。丹參是天然的傳統(tǒng)中藥，具有抗炎、抗菌、抗氧化等藥理作用，特別是對(duì)心血管系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)有較強(qiáng)的藥理活性，主要含有脂溶性成分丹參酮和水溶性成分丹參酚酸、丹參素等[3]。有研究表明，丹參酮防治OA可能是通過(guò)提高軟骨細(xì)胞的活性，對(duì)抗氧自由基來(lái)防止軟骨的破壞[4]。文獻(xiàn)報(bào)道[5-6]，丹參注射液可以抑制體外兔軟骨細(xì)胞凋亡，關(guān)節(jié)腔注射丹參注射液治療OA，可以緩解膝關(guān)節(jié)軟骨退變。丹參水提液(water extract of Danshen, DWE)是否可防治大鼠OA，尚未見報(bào)道。因此，本實(shí)驗(yàn)采用關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射碘乙酸鈉(monosodium iodoacetate, MIA)建立大鼠OA模型，通過(guò)ELISA法、組織病理學(xué)、Micro-CT等技術(shù)，探討DWE對(duì)MIA所致大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨退變的預(yù)防作用，為OA的治療提供新的思路。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)6月齡SD ♀大鼠27只，體質(zhì)量(286±19)g，購(gòu)自廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：SCXK 桂 2014-0002。開始實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1個(gè)月，實(shí)驗(yàn)時(shí)平均體質(zhì)量為(295±22)g。每周稱量體質(zhì)量1次，且稱量前1 d禁食、不禁水。

1.2藥物與試劑MIA(貨號(hào)：305-53-3，批號(hào)：19148)，購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，避光稱量120 mg MIA粉末于5 mL無(wú)菌EP管中，加入3 mL生理鹽水，配成濃度為60 g·L-1MIA溶液(造模前1 d配制，避光保存于4 ℃?zhèn)溆?。丹參購(gòu)自黃岡金貴中藥產(chǎn)業(yè)發(fā)展有限公司，批號(hào)：D7020305，將一定的丹參藥材與單蒸水煎煮，濃縮成一定體積，以丹參素為含量計(jì)算，得到的DWE含丹參素濃度為1～1.2 g·L-1?；|(zhì)金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13, MMP-13)ELISA試劑盒，武漢伊萊瑞特生物科技股份有限公司；白介素6(interleukin 6, IL-6)ELISA試劑盒、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNF-α)ELISA試劑盒，均購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)股份有限公司；改良番紅O-固綠軟骨染色液，索萊寶科技有限公司。

1.3儀器石蠟切片機(jī)(德國(guó)Leica公司)；光學(xué)顯微鏡(日本Nikon公司)；viva Micro-CT 40(瑞士SCANCO Medical AG)；AE240電子天平(梅特勒·托利多儀器公司上海分公司)。

Tab 1 Body weight changes of rats in each experimental n=9)

1.4方法27只♀ SD大鼠隨機(jī)分為3組，每組9只，分別為：假手術(shù)組(Sham)、MIA組、DWE組。Sham組在大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入生理鹽水50 μL，MIA與DWE組在大鼠左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入MIA溶液50 μL[7]。注射MIA后d 2開始灌胃給藥，Sham與MIA組給予生理鹽水5 mL·kg-1， DWE組給予DWE 5 mL·kg-1。所有大鼠每天灌胃1次，連續(xù)給藥6周，每周稱體質(zhì)量1次，并按大鼠體質(zhì)量變化調(diào)整給藥量。實(shí)驗(yàn)結(jié)束，麻醉后心臟采血處死，分離血清，-80 ℃保存?zhèn)溆?。取左?cè)脛骨和股骨用10%中性甲醛固定12 h，換70%乙醇保存，備用。

1.5血清相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè)采用ELISA法檢測(cè)血清中MMP-13、IL-6、TNF-α水平，具體方法按照試劑盒說(shuō)明書操作。

1.6Micro-CT檢測(cè)掃描前，取脛骨浸泡于顯影液中，水浴鍋恒溫(37 ℃)浸泡20 min進(jìn)行掃描。掃描參數(shù)為：圖像矩陣為2 048×2 048×223，整合時(shí)間為200 ms，能量/強(qiáng)度為45 kVp、177 μA、8 W，以1 200 mg HA/cm校正CT值，0角度旋轉(zhuǎn)，進(jìn)行掃描。掃描完成后，用Micro-CT自帶軟件對(duì)骨組織重組圖像進(jìn)行三維旋轉(zhuǎn)，以確保橫向軸與垂直軸對(duì)齊，進(jìn)行定量分析內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)面軟骨厚度時(shí)，選取以正中心前后各2.0 mm，共層厚4.0 mm的關(guān)節(jié)組織為測(cè)量區(qū)域(regional of interest, ROI)進(jìn)行三維圖像重組，以最低閾值為170提取圖像信息。在對(duì)應(yīng)的關(guān)節(jié)面ROI下對(duì)軟骨以及軟骨下骨小梁進(jìn)行三維圖像重組?？傻玫揭韵聟?shù)：軟骨體積(cartilage volume)、軟骨厚度(cartilage thickness)[8]。分析重建后的軟骨體積和軟骨厚度，可以反映軟骨的破壞程度。軟骨體積越小、厚度越薄，則表示軟骨退化、結(jié)構(gòu)破壞越嚴(yán)重。

1.7番紅O-固綠軟骨染色檢查將股骨脫鈣、脫水、透明、石蠟包埋，4 μm厚度的組織切片備用。將股骨石蠟切片經(jīng)過(guò)烤片、脫蠟、染色、封片，得到番紅O-固綠染色組織片[9]。做OARSI(Osteoarthritis Research Society International, OARSI)病理學(xué)評(píng)分[10]。

2 結(jié)果

2.1各組大鼠一般狀態(tài)和體質(zhì)量變化在進(jìn)行OA造模時(shí)，關(guān)節(jié)腔注射MIA的大鼠膝關(guān)節(jié)從進(jìn)針處開始出現(xiàn)紅斑，腫脹現(xiàn)象隨時(shí)間逐漸蔓延到整個(gè)膝關(guān)節(jié)，關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫熱痛，大鼠行動(dòng)減少，左后肢屈縮、跛行，進(jìn)食量下降，精神萎靡，體質(zhì)量下降。注射生理鹽水的大鼠起初會(huì)出現(xiàn)紅斑，但數(shù)小時(shí)后紅斑消退。1周后，大鼠精神狀態(tài)和進(jìn)食慢慢恢復(fù)，隨著給藥的進(jìn)行，DWE組的腫脹程度較MIA組輕，活動(dòng)較MIA組靈敏，Sham組大鼠膝關(guān)節(jié)無(wú)腫脹且活動(dòng)靈敏。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中，除了造模后的1周體質(zhì)量有所下降，各組大鼠的體質(zhì)量都有所增加，但是體質(zhì)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Tab 1)。

2.2各組大鼠血清生化指標(biāo)的變化由Fig 1可見，與Sham組相比，MIA組血清MMP-13水平明顯升高(P<0.01)，IL-6和TNF-α有上升的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與MIA組相比，DWE組的MMP-13水平明顯降低(P<0.05)，IL-6和TNF-α有降低的趨勢(shì)，但無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

2.3各組大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的變化

2.3.1各組大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT定量參數(shù)的變化 由Fig 2可見，與Sham組相比，MIA組的軟骨厚度和軟骨體積均明顯減小(P<0.01)；與MIA組相比，DWE組的軟骨厚度和軟骨體積均明顯增加(P<0.01，P<0.05)。

2.3.2各組大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的二維、三維圖結(jié)構(gòu)變化 由脛骨內(nèi)側(cè)軟骨Micro-CT的二維圖與三維圖可見(Fig 3)，與Sham組相比，MIA組軟骨厚度明顯變薄；與MIA組相比，DWE組的軟骨厚度有所增厚。

2.4各組大鼠股骨內(nèi)側(cè)關(guān)節(jié)軟骨番紅O-固綠染色變化番紅O-固綠染色結(jié)果顯示(Fig 4)，Sham組關(guān)節(jié)軟骨無(wú)骨關(guān)節(jié)炎表現(xiàn)，表面完整、平滑，軟骨細(xì)胞排列正常，數(shù)量正常，核染正常，軟骨基質(zhì)著色鮮紅；MIA組關(guān)節(jié)面糜爛、缺損、變形，損傷占比超過(guò)50%，軟骨結(jié)構(gòu)消失，軟骨層進(jìn)行性喪失或者損壞，軟骨細(xì)胞數(shù)量減少，排列紊亂，有簇集現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色變淺；DWE組損傷占比在10%～25%之間，軟骨表面稍不平整，局部出現(xiàn)軟骨細(xì)胞簇集，細(xì)胞數(shù)量減少，基質(zhì)著色變淺。將染色的組織片經(jīng)過(guò)OARSI病理學(xué)評(píng)分，結(jié)果如Fig 5所示，與Sham組比較，MIA組大鼠股骨關(guān)節(jié)面軟骨OARSI病理學(xué)評(píng)分明顯提高(P<0.01)；與MIA組比較，DWE組大鼠關(guān)節(jié)面軟骨OARSI病理學(xué)評(píng)分明顯降低(P<0.01)。

Fig 1 Changes in serum biochemical parameters of rats in each n=8)

**P<0.01vssham group;#P<0.05vsMIA group

Fig 2 Changes of medial cartilage thickness in tibia and articular surface of rats in each

**P<0.01vssham group;#P<0.05,##P<0.01vsMIA group

3 討論

隨著人口老齡化問(wèn)題的突出，OA已成為提高中老年人生活質(zhì)量的一大障礙，因此，建立合適的動(dòng)物模型來(lái)研究OA非常重要。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA誘發(fā)OA模型，手術(shù)簡(jiǎn)單方便、造模時(shí)間短、造模穩(wěn)定、受其他因素干擾少，且造成關(guān)節(jié)漸進(jìn)性退變[11]。從大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨的Micro-CT結(jié)果可以看出，與Sham組相比，MIA組的軟骨厚度明顯變薄，軟骨體積減少，提示關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA可導(dǎo)致大鼠脛骨關(guān)節(jié)面軟骨退化和結(jié)構(gòu)破壞。從大鼠股骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨番紅O-固綠染色的組織切片及病理學(xué)評(píng)分結(jié)果可以看出，MIA組關(guān)節(jié)面糜爛、缺損、變形，損傷占比超過(guò)50%，軟骨結(jié)構(gòu)消失，軟骨層變薄，軟骨細(xì)胞數(shù)量變少，排列紊亂，有簇集現(xiàn)象，軟骨基質(zhì)著色變淺。與Sham組相比，MIA組的OARSI病理學(xué)評(píng)分明顯提高，提示關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA可導(dǎo)致大鼠股骨關(guān)節(jié)面軟骨退化和結(jié)構(gòu)破壞。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，大鼠關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射MIA可以誘發(fā)OA。MIA能使軟骨細(xì)胞凋亡、軟骨基質(zhì)降解，是一種甘油醛-3磷酸脫氫酶抑制劑[12]。在大鼠關(guān)節(jié)腔注射MIA后，會(huì)導(dǎo)致關(guān)節(jié)軟骨出現(xiàn)損傷，出現(xiàn)軟骨蛋白多糖基質(zhì)的丟失和關(guān)節(jié)功能障礙等類似于人類OA發(fā)病時(shí)的癥狀[13]。MIA可能活化caspase-3來(lái)誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡[14]，但是其確切的機(jī)制尚未明確。

Fig 3 Micro-CT 2D map and 3D map of medial cartilage thickness of each group

Fig 4 Histopathological observation of femoral medial articular cartilage in each group(Safranine O-fixed green staining,×200)

A: Sham; B: MIA; C: DWE.

Fig 5 OARSI score of femoral medial

**P<0.01vssham group;##P<0.01vsMIA group

由大鼠脛骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨的Micro-CT結(jié)果可以看出，DWE組的軟骨厚度和軟骨體積均比MIA組明顯增加，提示DWE可延緩MIA所致大鼠脛骨關(guān)節(jié)面的軟骨退化和結(jié)構(gòu)破壞。從大鼠股骨關(guān)節(jié)面內(nèi)側(cè)軟骨番紅O-固綠染色的組織切片及病理學(xué)評(píng)分結(jié)果可以看出，DWE組損傷占比在10%～25%之間，軟骨表面稍不平整，局部出現(xiàn)軟骨細(xì)胞簇集，細(xì)胞數(shù)量變少，基質(zhì)著色變淺。此外，DWE組OARSI病理學(xué)評(píng)分明顯比MIA組低，提示DWE可延緩MIA所致大鼠股骨關(guān)節(jié)面的軟骨退化和結(jié)構(gòu)破壞。結(jié)果進(jìn)一步說(shuō)明，DWE對(duì)MIA所致大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨退變有一定的保護(hù)作用。

由血清檢測(cè)結(jié)果可見，DWE組的MMP-13水平比MIA組低，提示丹DWE延緩MIA所致大鼠骨關(guān)節(jié)軟骨退化的作用可能與抑制MMP-13有關(guān)。文獻(xiàn)報(bào)道，丹參注射液減輕軟骨損傷可能是通過(guò)修正在OA軟骨組織中MMP-9和TIMP-1的異常表達(dá)[5]，也可能是通過(guò)抑制軟骨細(xì)胞線粒體調(diào)亡通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，進(jìn)而抑制其凋亡[6]。但是DWE的確切作用機(jī)制，還有待于深入研究。丹參分為脂溶性和水溶性兩大類成分，水溶性成分主要為酚酸類化合物，具有改善微循環(huán)、增強(qiáng)耐缺氧能力、保護(hù)腦組織缺血/再灌注損傷、抗炎、抗氧化等藥理活性。此外，丹參水溶性成分還可通過(guò)抗氧化應(yīng)激作用而調(diào)節(jié)骨代謝[15]。文獻(xiàn)報(bào)道，氧化應(yīng)激在MIA誘導(dǎo)大鼠軟骨細(xì)胞凋亡過(guò)程中起著重要的上調(diào)作用[14]。DWE防治大鼠OA的作用是否與其抗氧化應(yīng)激作用有關(guān)，還有待于深入研究。