向曉雪，艾佳晨，趙 科，劉志壽，向菊芳，華曉萍，譚正懷

(1. 四川中醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校藥學(xué)院，四川 綿陽 621000；2. 昆明科靈生物科技有限公司，云南 昆明 650000；3. 四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川 成都 610041；4. 大竹縣人民醫(yī)院藥劑科，四川 達(dá)州 625100;5. 成都中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610072；6. 四川大學(xué)藥學(xué)院，四川 成都 610014)

WHO發(fā)布的《2017年全球結(jié)核病報(bào)告》指出：據(jù)估算，2016年全球新發(fā)結(jié)核病患者約1 040萬例，與2015年一致[1]。目前，我國仍然是全球30個(gè)結(jié)核病高負(fù)擔(dān)國家之一，每年新發(fā)結(jié)核病患者約90萬例，位居全球第3位[2]。治療結(jié)核病需要多種抗結(jié)核藥物聯(lián)合使用半年以上，而這些藥物所致的主要毒性或不良反應(yīng)是肝毒性，輕者為血清氨基轉(zhuǎn)移酶一過性升高，在療程中可自行恢復(fù)。重者則表現(xiàn)為食欲不佳、異常乏力或軟弱、惡心或嘔吐、深色尿、眼或皮膚黃染，嚴(yán)重者出現(xiàn)肝衰竭[3]。異煙肼(isoniazid, INH)、利福平(rifampicin, RIF)、吡嗪酰胺、乙胺丁醇均可引起肝臟損害[4]。許多患者由于發(fā)生嚴(yán)重的肝臟毒性而不得不終止治療，反復(fù)多次終止治療常誘發(fā)結(jié)核桿菌的耐藥性，最終導(dǎo)致患者無藥可治而死亡[5]。

研發(fā)針對(duì)抗結(jié)核藥物所致肝損傷的治療藥物，是全球醫(yī)藥工作者所追求的主要目標(biāo)。研究藥物的主要工具是動(dòng)物模型，目前已經(jīng)建立了RIF聯(lián)合INH致動(dòng)物肝損傷模型[6-7]，但單獨(dú)使用RIF或INH復(fù)制肝損傷模型，以及INH和RIF聯(lián)合使用所致肝損傷3種動(dòng)物模型的異同，INH與RIF合用對(duì)肝損傷的相互作用本質(zhì)等問題，均未得到相關(guān)實(shí)驗(yàn)佐證。為此，本文擬通過析因設(shè)計(jì)，探討INH、RIF單獨(dú)使用致肝損傷的特點(diǎn)，RIF、INH二藥在RIF聯(lián)合INH致肝損傷中的地位及相互作用。

1 材料

1.1藥物與試劑利福平膠囊(每粒0.15 g，批號(hào)：171102)、異煙肼片(每片0.1 g，批號(hào)：150901)，均為成都錦華藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。臨用前，用0.5% CMC配成所需濃度的混懸液備用。直接膽紅素(direct bilirubin，DBIL，貨號(hào)：CH0105004)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(alanine aminotransferase，ALT，貨號(hào)：CH0105201)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(aspartate aminotransferase，AST，貨號(hào)：CH0105202)、總膽紅素(total bilirubin, TBIL，貨號(hào)：CH0105003) 測定試劑盒，均購自四川邁克生物科技股份有限公司。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物昆明種(KM)小鼠，SPF級(jí)，♂，體質(zhì)量(18～22) g，由四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(川)-2013-19。小鼠飼養(yǎng)于四川省中醫(yī)藥科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障系統(tǒng)，合格證號(hào)：SYXK(川)-2013-100，室溫(22～25) ℃，濕度(50±5)%，明暗各12 h。

1.3儀器7020型全自動(dòng)生化分析儀(日本株式會(huì)日立高新技術(shù))。

2 方法

2.1分組與指標(biāo)檢測

2.1.1單獨(dú)灌胃RIF 1次后不同時(shí)間對(duì)小鼠的影響 90只小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后，按照體質(zhì)量隨機(jī)分成對(duì)照組、RIF 100 mg·kg-14個(gè)時(shí)間點(diǎn)組、 RIF 300 mg·kg-14個(gè)時(shí)間點(diǎn)組，每組10只。分別灌胃RIF 100、300 mg·kg-1或等體積0.5% CMC-Na溶液。給藥后禁食不禁水,分別在給藥后2、4、8、12 h處理小鼠，稱體重，斷頭取血，用全自動(dòng)生化儀測ALT、AST、TBIL、DBIL，取肝臟，計(jì)算肝指數(shù)。

2.1.2連續(xù)灌胃RIF、INH或RIF+INH對(duì)小鼠的影響 小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 d后，采用析因設(shè)計(jì)，按照體質(zhì)量隨機(jī)分成對(duì)照組、INH 150 mg·kg-1組、RIF 300 mg·kg-1組、RIF 150 mg·kg-1+INH 300 mg·kg-14個(gè)大組，每個(gè)大組又隨機(jī)再分為3個(gè)小組，即給藥1周、給藥2周、給藥3周組。每天灌胃給藥，連續(xù)給藥至預(yù)定時(shí)間點(diǎn)，禁食不禁水16 h后，取血清，測定其ALT、AST、TBIL， 取肝臟稱濕重，計(jì)算其臟器指數(shù)；取部分肝臟置于10%福爾馬林中固定后進(jìn)行切片，HE染色。由病理學(xué)專家在顯微鏡下根據(jù)Tab 1的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行盲法評(píng)分。

3 結(jié)果

3.1灌胃RIF1次后小鼠血清轉(zhuǎn)氨酶活性不隨時(shí)間發(fā)生明顯變化由Tab 2可見，灌胃RIF 100 mg·kg-1或RIF 300 mg·kg-1后8 h內(nèi)，小鼠血清ALT和AST活性均無明顯改變，于給藥后12 h血清轉(zhuǎn)氨酶活性有所降低，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與給藥組禁食時(shí)間較長有關(guān)，無任何生物學(xué)意義。灌胃RIF 100 mg·kg-1或RIF 300 mg·kg-1后12 h內(nèi)，小鼠總膽紅素和直接膽紅素均明顯升高，一直升高到給藥后12 h，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。隨著給藥后禁食時(shí)間的延長，其肝臟指數(shù)逐漸減小，并在給藥后12 h與對(duì)照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示肝臟指數(shù)的改變可能與禁食時(shí)間密切相關(guān)，而與血中膽紅素水平的變化無明顯相關(guān)性。

3.2連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF1周對(duì)小鼠肝損傷相關(guān)指標(biāo)的影響由Tab 3可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-11周，可明顯增加小鼠肝臟指數(shù)，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)其他指標(biāo)無明顯影響，同時(shí)病理學(xué)檢查結(jié)果顯示(Fig 1)，小鼠肝臟無明顯損傷；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-11周，可明顯增加小鼠肝臟指數(shù)，升高ALT、AST及TBIL水平，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)病理學(xué)結(jié)果顯示(Fig 1)，小鼠肝細(xì)胞空泡形成明顯，且INH+RIF組病變更為嚴(yán)重，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

3.3連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF2周對(duì)小鼠肝損傷相關(guān)指標(biāo)的影響Tab 4、Fig 1結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-12周，對(duì)小鼠肝臟組織有輕度損傷，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，對(duì)小鼠肝組織造成較重的損傷，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，與INH組比較差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，RIF組與INH+RIF組之間病變程度差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

由Tab 4可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1、INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，均可明顯增加小鼠肝臟指數(shù)，升高小鼠血清AST、TBIL水平，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-12周，均可明顯增加小鼠ALT血清水平，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tab 5的析因方差分析結(jié)果顯示，在增加小鼠肝臟指數(shù)，升高小鼠血清ALT方面， INH和RIF均有明顯作用，在增加小鼠血清AST、TBIL水平方面，RIF發(fā)揮了主要作用；同時(shí)，除了在TBIL方面，INH和RIF無相互作用，其他方面均顯現(xiàn)出一定的相互拮抗作用，尤其是對(duì)肝臟指數(shù)及ALT的影響，INH和RIF聯(lián)用拮抗作用較為明顯。

3.4連續(xù)灌胃RIF、INH、INH+RIF3周對(duì)小鼠肝損傷相關(guān)指標(biāo)的影響Tab 6、Fig 1結(jié)果顯示，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，對(duì)小鼠肝組織均可造成損傷，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周較連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-13周引起的肝損傷更為嚴(yán)重，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但RIF組與RIF+INH組之間無明顯差異。

Tab 2 Effects on liver function index at different time after once-daily treatment of RIF in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Fig1EffectsofINH,RIForINH+RIFonliverhistopathologyinmiceatdifferenttime(HE×200) A: Control group; B: Administered INH for one week; C: Administered RIF for one week; D: Administered RIF+INH for one week; E: Administered INH for two weeks; F: Administered RIF for two weeks; G: Administered INH+RIF for two weeks; H: Administered INH for three weeks; I: Administered RIF for three weeks; J: Administered INH+RIF for three weeks.

Tab 3 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for one week in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsRIF group

Tab 4 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for two weeks in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group

Tab 5 Liver index and hepatic biochemical index of factorial design AONVA in mice after successive medication for two weeks

由Tab 6可見，連續(xù)灌胃INH 150 mg·kg-1、RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，均可明顯增加小鼠肝臟指數(shù)；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-1或INH 150 mg·kg-1+RIF 300 mg·kg-13周，均可明顯升高小鼠血清ALT、TBIL水平；連續(xù)灌胃RIF 300 mg·kg-13周，可明顯增加小鼠AST水平，與對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。Tab 7的析因方差分析結(jié)果顯示，RIF與INH聯(lián)用，RIF、INH在小鼠血清ALT水平升高中均發(fā)揮了作用；RIF對(duì)肝臟指數(shù)增加，AST、TBIL水平升高有明顯作用，而INH的作用不明顯；同時(shí)，結(jié)果顯示INH與RIF聯(lián)用過程中，對(duì)小鼠的肝指數(shù)，ALT、TBIL水平的影響均表現(xiàn)出明顯的相互拮抗作用。

4 討論

長期以來，人們普遍認(rèn)同RIF對(duì)肝臟引起的損傷主要是膽汁淤積所致，但其是否對(duì)肝細(xì)胞有直接損傷未見報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)，單次灌胃RIF即可引起直接膽紅素和總膽紅素明顯升高，而對(duì)肝損傷相關(guān)指標(biāo)如ALT、AST以及肝臟指數(shù)，均無明顯影響，證實(shí)了RIF對(duì)肝的損傷作用主要因?yàn)槟懼拈g接作用，而對(duì)肝組織無明顯的直接損傷作用。同時(shí)，也有文獻(xiàn)認(rèn)為RIF單獨(dú)使用對(duì)肝臟的毒性作用較小[8]，也有報(bào)道大鼠、小鼠單獨(dú)使用RIF均可表現(xiàn)明顯的肝臟毒性[9]。本研究發(fā)現(xiàn)，RIF在給藥1周后即出現(xiàn)明顯的肝臟毒性，隨著給藥時(shí)間的延長，其毒性作用逐漸增加，尤其以膽紅素和肝臟指數(shù)表現(xiàn)突出。

Tab 6 Effects on liver function index after successive medication of RIF/INH for three weeks in

*P<0.05,**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsINH group

Tab 7 Liver index and hepatic biochemical index of factorial design AONVA in mice after successive medication for three weeks

臨床上發(fā)現(xiàn)INH單獨(dú)使用對(duì)肝臟具有明顯的毒性作用，癥狀為黃疸，伴惡心、嘔吐、厭食等臨床表現(xiàn)[10]。有文獻(xiàn)報(bào)道[11]，大鼠單獨(dú)使用INH可引起明顯的肝損傷；但也有學(xué)者將介導(dǎo)異煙肼肝毒性的代謝產(chǎn)物肼和乙酰肼對(duì)小鼠進(jìn)行染毒，染毒劑量設(shè)置為100 mg·kg-1，結(jié)果并未發(fā)現(xiàn)明顯的藥物性肝損傷[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，單獨(dú)使用INH 150 mg·kg-1(相當(dāng)于臨床人用量的60倍)對(duì)小鼠僅有輕度肝損傷，這種損傷主要發(fā)生在連續(xù)給藥后2～3周，且僅表現(xiàn)在組織上，其轉(zhuǎn)氨酶及總膽紅素的變化并不大。

INH、RIF的聯(lián)合干預(yù)通常作為針對(duì)結(jié)核桿菌的一線治療方式，其常見的不良反應(yīng)為藥物性肝損傷[13]。亦有資料顯示，無論大鼠或小鼠聯(lián)合應(yīng)用INH和RIF，均可引起明顯的肝臟毒性作用[6-7]。INH、RIF聯(lián)用毒性增強(qiáng)的機(jī)制目前并未完全闡明，有人認(rèn)為是肝藥酶之間的相互作用所致[14]，也有人認(rèn)為是RIF通過細(xì)胞色素P450和孕烷X受體(pregnane X receptor, PXR)增加INH的代謝[15]。

目前，RIF是否能增加INH的肝毒性尚有爭議。有文獻(xiàn)指出，INH的肼類代謝產(chǎn)物為聯(lián)合化療時(shí)產(chǎn)生肝毒性的主要因素，RIF的肝微粒體酶誘導(dǎo)作用可增強(qiáng)INH的肝毒性，對(duì)膽紅素代謝產(chǎn)生競爭性抑制[14]。但也有研究以大鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，發(fā)現(xiàn)RIF不會(huì)增加由INH誘導(dǎo)的DNA加合物的形成，不會(huì)增加INH誘導(dǎo)的肝臟CYP2E1的氧化作用[16]。本文研究發(fā)現(xiàn)，無論在肝臟指數(shù)、轉(zhuǎn)氨酶活性以及肝臟病理評(píng)分方面，INH均有明顯拮抗RIF肝臟毒性的作用，其機(jī)制可能與降低血液總膽紅素水平有關(guān)，詳細(xì)機(jī)制有待進(jìn)一步探討。

由此可見，建立INH和RIF所致的小鼠肝損傷模型，若單獨(dú)采用INH灌胃給藥的方式建模，小鼠肝損傷程度較小，使用意義不大；單獨(dú)采用RIF或聯(lián)合INH對(duì)小鼠灌胃給藥，均可建立較成功的小鼠肝損傷模型。同時(shí)，本研究結(jié)果還提示，對(duì)于小鼠，在RIF與INH聯(lián)合使用時(shí)，其肝毒性主要來源于RIF，后者對(duì)肝臟毒性則主要因?yàn)槟懼俜e。因此有效解決膽汁淤積，可能是防治RIF聯(lián)合INH所致肝毒性的有效途徑之一。

(致謝：本實(shí)驗(yàn)在四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥藥理毒理研究所完成，在此對(duì)實(shí)驗(yàn)過程給予指導(dǎo)和幫助的老師和同學(xué)們表示感謝！)