藺 瑩，姚瓔珈，梁喜才，時(shí) 悅，倪穎男，吳雨桐，楊靜嫻

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 116600)

阿爾茨海默病( Alzheimer’s disease，AD )是一種發(fā)病過程漫長(zhǎng)，多發(fā)生于中老年人，具有一定遺傳性的神經(jīng)退行性疾病。主要的臨床表現(xiàn)為記憶力的減退以及認(rèn)知功能的缺失[1-2]。關(guān)于AD的發(fā)病機(jī)制存在著多種假說，其中β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein,Aβ)沉積學(xué)說是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。β-分泌酶1(β-site APP cleaved enzyme-1,BACE-1)作為Aβ生成的限制酶，促進(jìn)淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)水解成Aβ，間接控制著Aβ產(chǎn)生。BACE-1活性增強(qiáng)，Aβ生成增多，易導(dǎo)致Aβ異常聚集，沉積在腦內(nèi)引起炎癥等反應(yīng)，造成神經(jīng)元丟失、腦組織萎縮[3-4]。因此，抑制BACE-1表達(dá)，減少Aβ的生成，可以延緩AD的發(fā)生。

蛇床子素(osthole,OST)又名甲氧基歐芹酚(C15H16O3)，是傘形科植物獨(dú)活中的活性單體[5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)發(fā)現(xiàn)，OST具有廣泛的藥理作用，包括抗炎、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激等[5-7]。中醫(yī)中，獨(dú)活具有溫腎壯陽(yáng)、燥濕、祛風(fēng)、殺蟲等作用。實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，OST可以調(diào)控miRNA-9，并且對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的保護(hù)作用[8-10]。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，以20 mg·kg-1OST灌胃給予APP/PS1小鼠，對(duì)AD有一定的治療作用[11]。

MicroRNAs (miRNAs)是一種調(diào)節(jié)內(nèi)源性基因的非編碼小RNA，它主要通過抑制mRNA的翻譯或促進(jìn)其降解而發(fā)揮作用[12]。近年來研究表明，AD的發(fā)生與多種miRNAs異常表達(dá)相關(guān)。現(xiàn)代藥理學(xué)研究中，miRNAs可以作為診斷某種疾病的標(biāo)志，并且miRNAs幾乎可以調(diào)控人體內(nèi)每一個(gè)生理過程[13]。本實(shí)驗(yàn)利用基因芯片技術(shù)，篩選差異表達(dá)的miRNA，并利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控的下游靶基因，探討OST治療AD的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞株 9月齡的APP/PS1雙轉(zhuǎn)基因小鼠20只，♀♂各半，體質(zhì)量(26±4)g，購(gòu)自北京中科澤晟生物技術(shù)有限公司[SCXK(京)2013-0002]；SPF級(jí)C57BL/6小鼠10只，♀♂各半，體質(zhì)量(23±3)g，購(gòu)于遼寧長(zhǎng)生生物有限公司[SCXK(遼)：2010-0001]。293T細(xì)胞株、人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株SH-SY5Y，均由首都醫(yī)科大學(xué)提供。

1.1.2試劑 OST，購(gòu)于中藥食品藥品研究所(批號(hào)：110822-200407)；APP595/596質(zhì)粒、GFP質(zhì)粒，以及輔助質(zhì)粒 pLP1、pLP2、pMDG，由天津醫(yī)科大學(xué)提供；miRNA-9抑制劑，蘇州吉瑪基因股份有限公司產(chǎn)品；BACE-1引物，大連萬(wàn)澤生物技術(shù)有限責(zé)任公司產(chǎn)品；兔抗BACE-1、兔抗β-actin抗體，北京博奧森生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品；DAPI染液，美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品；Bradford法蛋白濃度試劑盒，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司產(chǎn)品。

1.1.3儀器 天平(德國(guó)賽多利斯艾科勒)；Ti-S型熒光顯微鏡(日本尼康公司)；二氧化碳培養(yǎng)箱(美國(guó)Nuaire公司)；MG96G PCR儀(杭州朗基科學(xué)儀器有限公司)；水平核酸電泳儀、半干式蛋白轉(zhuǎn)膜儀(美國(guó)Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)、MR-96A酶標(biāo)儀(深圳邁瑞公司)。

1.2方法

1.2.1基因芯片技術(shù)篩選差異表達(dá)miRNA 取OST16 mg，溶解于2 mL PEG400中，加入ddH2O稀釋至4 mL，4 ℃?zhèn)溆谩?月齡APP/PS1小鼠，♀♂各半，將APP/PS1小鼠隨機(jī)分為模型組(APP組)和給藥組(OST組)，每組10只；另取C57BL/6小鼠作為空白對(duì)照組(Control)。給藥組小鼠以20 mg·kg-1OST灌胃給藥，每日兩次，連續(xù)灌胃6周；對(duì)照組及模型組小鼠則以等劑量50% PEG400灌胃。

分別取模型組、OST組和空白組小鼠整腦，每組3只，提取總RNA，委托上海歐易生物醫(yī)學(xué)科技有限公司，采用 Agilent Mouse miRNA, Release 21.0芯片完成樣本檢測(cè)和分析。根據(jù)熱圖結(jié)果以及差異倍數(shù)變化值，進(jìn)行差異miRNA篩選，篩選的標(biāo)準(zhǔn)為上調(diào)或者下調(diào)倍數(shù)變化值≥2.0，確定為OST調(diào)控較明顯的miRNAs。

1.2.2生物信息學(xué)預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控靶基因 利用TargetScan(http://www.targetscan.org/vert_70/)、PicTar(https://pictar.mdc-berlin.de/)、DIANA(http://diana.imis.athena-innovation.gr/DianaTools/index.php)3個(gè)miRNA靶點(diǎn)預(yù)測(cè)數(shù)據(jù)庫(kù)，預(yù)測(cè)差異表達(dá)miRNA的下游靶基因，并利用Cytoscape關(guān)于miRNA的插件CytargetLinker驗(yàn)證(https://projects.bigcat.unimaas.nl/cytargetlinker/linksets/)。

1.2.3APP高表達(dá)AD細(xì)胞模型的建立 將APP595/596、GFP以及輔助質(zhì)粒pLP1、pLP2、pMDG按照一定的比例[12]轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞；收集不同時(shí)間點(diǎn)的病毒液混合后，超濾管16 785×g離心1 h濃縮病毒液；將濃縮病毒液混合，并加入1%聚凝胺，轉(zhuǎn)染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤SH-SY5Y 細(xì)胞；用熒光倒置顯微鏡觀察綠色熒光，轉(zhuǎn)染3 d后，分別用RT-PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)APP mRNA及蛋白的表達(dá)量[12]。單純GFP轉(zhuǎn)染的正常SH-SY5Y細(xì)胞為空白對(duì)照組。

1.2.4MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性 將終濃度分別為25、50、75、100 μmol·L-1的OST分別加入APP高表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞中，并設(shè)APP高表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞為模型組，GFP轉(zhuǎn)染的正常SH-SY5Y細(xì)胞為空白對(duì)照組。每組3個(gè)復(fù)孔，每孔中加入100 μL培養(yǎng)基，培養(yǎng)過夜，加入MTT試劑，避光培養(yǎng)4 h；棄去培養(yǎng)液，加入DMSO溶液，搖床震搖10 min，最后在酶標(biāo)儀570 nm處測(cè)量吸光度。

1.2.5RT-PCR檢測(cè)miRNA-9和BACE-1 mRNA表達(dá) 將5 μL miRNA-9抑制劑加入到45 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，同時(shí)將5 μL脂質(zhì)體2000加入到45 μL基礎(chǔ)培養(yǎng)基，室溫放置5 min，將兩種混合物融合20 min后，加入到APP高表達(dá)的SH-SY5Y細(xì)胞中，即為抑制劑組；在此基礎(chǔ)上，再加入終濃度為50 μmol·L-1的OST，即OST+抑制劑組。按照方法“1.2.4”設(shè)立OST組(50 μmol·L-1)、模型對(duì)照組和空白對(duì)照組。各組細(xì)胞內(nèi)加入TRIzol提取RNA，稀釋后測(cè)定各組RNA純度，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后，-80 ℃保存。進(jìn)行PCR擴(kuò)增，按照以下比例配制PCR擴(kuò)增體系：DreamTag PCR Master Mix 25 μL，上、下游引物各1.5 μL，樣本cDNA 2 μL，水20 μL。反應(yīng)條件如下：95 ℃ 2 min；95 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。Image J進(jìn)行光密度掃描。引物序列見Tab 1，miRNA-9引物由廣州市銳博生物科技有限公司設(shè)計(jì)并合成，引物序列因涉及保密，不予公開。

Tab 1 Sequences of primer of RT-PCR

1.2.6Western blot法觀察BACE-1表達(dá) 按照“1.2.5”設(shè)立分組，提取各組細(xì)胞蛋白，測(cè)定蛋白質(zhì)濃度。各組蛋白上樣量均為50 μg，SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)至PDVF膜(100 V，1 h)，脫脂奶粉TBST液封閉1 h，兔抗BACE-1 (1 ∶200) 4 ℃孵育過夜，TBST洗膜后，與HRP標(biāo)記的二抗(1 ∶2 000)雜交，凝膠成像系統(tǒng)拍照保存，并用 Image J定量測(cè)定信號(hào)強(qiáng)度。

1.2.7統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，GraphPad Prim 5.0軟件繪制統(tǒng)計(jì)圖。由箱線圖判斷數(shù)據(jù)是否符合正態(tài)分布。符合正態(tài)分布的計(jì)量數(shù)據(jù)以表示，多組之間的比較采用方差分析，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1OST干預(yù)后差異表達(dá)miRNA篩選結(jié)果經(jīng)過歐易生物進(jìn)行各組小鼠腦組織樣本芯片篩選，結(jié)果顯示，模型組中上調(diào)的miRNAs有71個(gè)，下調(diào)的miRNAs 40個(gè)；而經(jīng)過OST治療后，與模型組性比，上調(diào)的miRNAs 25個(gè)，下調(diào)的miRNAs 53個(gè)，我們將差異倍數(shù)(fold change，F(xiàn)C)≥2作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，其中miRNA-9差異倍數(shù)>2。熱圖結(jié)果顯示(Fig 1)，miRNA-9在3組之間表達(dá)差異明顯，可見miRNA-9是OST調(diào)控較明顯的miRNA。

2.2生物信息學(xué)驗(yàn)證miRNA-9與BACE-1靶向結(jié)合通過TargetScan、PicTar、DIANA三個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行序列比對(duì)，發(fā)現(xiàn)miRNA-9可以與BACE-1靶向結(jié)合(Tab 2)，后續(xù)利用Cytoscape驗(yàn)證與BACE-1結(jié)合的miRNA有miRNA-9、miRNA-15b、miRNA-195等(Fig 2)。證明miRNA-9與BACE-1的靶向調(diào)控作用。

Tab 2 Sequence of miRNA-9 and BACE-1

Fig 1 MicroRNA differential expression demonstrated by clustering heat map

Fig 2 miRNA-9 binding to 3′-UTR of BACE-1 determined by bioinformatics

2.3成功建立APP高表達(dá)的AD細(xì)胞模型GFP慢病毒與帶有GFP標(biāo)記的APP慢病毒感染SH-SY5Y神經(jīng)細(xì)胞，成功感染GFP慢病毒與帶有GFP標(biāo)記的APP慢病毒的SH-SY5Y具有綠色熒光(Fig 3A)。培養(yǎng)3 d后，經(jīng)RT-PCR和Western blot驗(yàn)證，感染APP慢病毒的神經(jīng)細(xì)胞具有APP基因和蛋白的高表達(dá)(Fig 3B、3C),并且APP組中APP基因的表達(dá)是空白組(GFP組)的3倍，APP組中APP蛋白的表達(dá)是空白組的2倍,說明成功建立APP過表達(dá)的AD細(xì)胞模型。

Fig 3 Establishment of AD cells with over expression of APP

2.4OST對(duì)AD細(xì)胞模型的保護(hù)作用Fig 4的MTT結(jié)果顯示，OST對(duì)APP過表達(dá)SH-SY5Y細(xì)胞具有一定的保護(hù)作用。OST在50 μmol·L-1時(shí)，細(xì)胞的活力最高，而在75 μmol·L-1之后細(xì)胞活力呈下降趨勢(shì)。因此，后續(xù)細(xì)胞的給藥濃度選擇50 μmol·L-1。

Fig 4 Effects of osthole on cell activity n=3)

**P<0.01vsGFP group;##P<0.01vsAPP group

2.5OST通過上調(diào)miRNA-9抑制BACE-1mRNA表達(dá)將miRNA-9抑制劑轉(zhuǎn)染到AD細(xì)胞模型中，以O(shè)ST濃度50 μmol.L-1給藥，建立抑制劑組、OST+抑制劑共處理組。RT-PCR結(jié)果顯示(Fig 5)，與空白組相比，APP組中miRNA-9的表達(dá)明顯降低，給予OST治療后miRNA-9的表達(dá)相對(duì)模型組有所提高。BACE-1 mRNA在各組中的表達(dá)與miRNA-9的表達(dá)呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)關(guān)系，模型組中BACE-1表達(dá)明顯增多，OST可以降低BACE-1的表達(dá)，抑制劑組BACE-1表達(dá)最多，OST與抑制劑共處理組BACE-1表達(dá)介于抑制劑組和OST組之間。

2.6OST通過上調(diào)miRNA-9抑制BACE-1蛋白的表達(dá)Fig 6的Western blot結(jié)果顯示，與GFP組相比，APP組的BACE-1蛋白明顯增多，給予OST治療后，BACE-1蛋白表達(dá)相對(duì)APP組有所降低，而抑制劑組BACE-1蛋白表達(dá)最多，OST與抑制劑共處理組BACE-1蛋白表達(dá)介于OST組和抑制組之間。說明OST可以通過上調(diào)miRNA-9，抑制BACE-1蛋白的表達(dá)。

3 討論

AD是一種常見的嚴(yán)重影響人們生活質(zhì)量的疾病，其特征為腦內(nèi)積聚老年斑及神經(jīng)原纖維纏結(jié)[13]，AD現(xiàn)已成為降低人類生活質(zhì)量最嚴(yán)重的疾病之一。AD發(fā)生存在著多種假說，其中Aβ學(xué)說是當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。正常人腦中Aβ的產(chǎn)生與降解會(huì)保持平衡，而BACE-1活性增強(qiáng)會(huì)加速對(duì)APP的裂解，從而大量生成Aβ，導(dǎo)致Aβ的沉積，產(chǎn)生神經(jīng)毒性[14]，激活一系列病理改變，進(jìn)而誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞的凋亡。因此，減少腦內(nèi)APP裂解，即抑制BACE-1活性，就可以達(dá)到治療AD的作用。

Fig 5 Effects of osthole on expression of miR-9 and

**P<0.01vsGFP,##P<0.01vsAPP

Fig 6 Expression of BACE-1 with osthole treatment in cells n=10)

**P<0.01vsGFP;##P<0.01vsAPP

本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，OST作為一種天然香豆素類化學(xué)成分，可以通過miRNAs直接調(diào)控下游靶基因，并且可以促進(jìn)神經(jīng)發(fā)生，改善APP/PS1小鼠腦區(qū)內(nèi)學(xué)習(xí)認(rèn)知能力[15]。本研究通過基因芯片技術(shù)，篩選OST干預(yù)APP/PS1小鼠后差異表達(dá)的miRNA-9，并且通過生物信息學(xué)分析，驗(yàn)證miRNA-9可以調(diào)控靶基因BACE-1的表達(dá)，將miRNA-9抑制劑轉(zhuǎn)入APP高表達(dá)的AD細(xì)胞模型，發(fā)現(xiàn)模型組與對(duì)照組相比，BACE1蛋白的表達(dá)明顯增高。給藥后，BACE1蛋白表達(dá)相對(duì)模型組明顯降低，抑制劑組BACE1蛋白表達(dá)最高，OST與抑制劑共處理組BACE1蛋白表達(dá)在給藥組與抑制劑組之間，差異皆有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明OST可以通過上調(diào)miRNA-9，抑制BACE-1表達(dá)，從而達(dá)到治療AD的作用。獨(dú)活抗AD的分子機(jī)制比較復(fù)雜，調(diào)控miRNA-9的內(nèi)在機(jī)制以及對(duì)其他miRNA的調(diào)控作用仍是未知，后續(xù)要通過大量實(shí)驗(yàn)研究，為獨(dú)活應(yīng)用于臨床治療AD提供依據(jù)。

綜上所述，OST能夠靶向調(diào)節(jié)miRNA-9，抑制BACE-1表達(dá)，從而達(dá)到治療AD的作用，本研究為治療AD相關(guān)新藥研發(fā)提供了重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。