趙軍華 周志杰 崔吉岡 倪靈凡 孟曉青

(洛陽東方醫(yī)院呼吸腎病科，洛陽 471003)

腎癌是最常見的10種癌癥之一，也是泌尿外科惡性腫瘤中最致命的惡性腫瘤。據(jù)統(tǒng)計2012年全世界新增腎癌病例33.8萬，腎癌死亡病例14.3萬[1]。腎癌治療是一個全球性的醫(yī)學難題。大量文獻報道許多微小RNA(MicroRNA，miR)在腎癌發(fā)生發(fā)展進程中發(fā)揮著重要作用[2]。MicroRNAs是在所有真核細胞中發(fā)現(xiàn)的長度約為22個核苷酸的短非編碼RNA，在幾乎所有的生物途徑中都扮演著重要的角色。MicroRNAs的異常表達常與包括癌癥在內(nèi)的各類疾病密切相關(guān)[3]。越來越多的數(shù)據(jù)表明MicroRNAs在癌癥治療方面具有很大的潛力[4]。深入研究MicroRNAs在癌癥中的作用對人類抗癌事業(yè)具有重要意義。據(jù)報道m(xù)iR-138-5p在非小細胞肺癌的耐藥性、胰腺癌細胞侵襲和遷移及鼻咽癌自噬方面具有重要作用[5-7]。但miR-138-5p在腎癌中的報道還十分罕見，有待進一步研究。本文的主要目的是探究miR-138-5p對人腎癌細胞GRC-1增殖、凋亡、侵襲和遷移的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1細胞系與主要試劑 人腎癌GRC-1細胞系購自美國典型培養(yǎng)物保藏中心 (American Type Culture Collection,ATCC)。DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清和轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent購自賽默飛世爾科技公司。miR-138 mimic、缺氧誘導因子(Hypoxia inducing factor,HIF)-1α過表達載體pc-HIF-1α以及含HIF-1α野生型和突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體由上海Genepharm公司合成。熒光素酶檢測試劑盒購自Promega公司。RNA提取試劑盒和定量PCR試劑盒SYBR Premix Ex TaqTM購自大連TaKaRa公司。miRNA定量PCR試劑盒TaqMan miRNA Assay購自Applied Biosystems公司。Transwell小室及人工基底膜購自美國BD公司?？笻IF-1α抗體購自英國Abcam公司。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) 腎癌GRC-1細胞培養(yǎng)于添加10%胎牛血清和1%青-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當細胞增殖密度到約80%時進行傳代。

1.2.2細胞分組與轉(zhuǎn)染 GRC-1細胞機分為5組：對照(GRC-1)組、mimic-scramble組、miR-138 mimic組、HIF-1α過表達(pc-HIF-1α)組和共轉(zhuǎn)染(mimic+pc-HIF-1α)組。mimic-scramble為miR-138 mimic的陰性對照隨機序列。按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說明書將miR-138 mimic和pc-HIF-1α分別或者同時轉(zhuǎn)入GRC-1細胞中。轉(zhuǎn)染 48 h 后進行后續(xù)實驗。

1.2.3熒光素酶分析 首先按照轉(zhuǎn)染試劑TurboFect Transfection Regent說明書將HIF-1α野生型或突變型的熒光素酶報告基因質(zhì)粒載體單獨轉(zhuǎn)入細胞中，或同時添加miR-138 mimic轉(zhuǎn)入細胞，培養(yǎng)48 h后移去培養(yǎng)液。然后用洗滌液洗滌細胞，棄去洗滌液后向孔中加入1×的細胞裂解液將細胞裂解。室溫下振蕩器上振蕩5～10 min，再移入離心管中3 000 r/min 離心5 min，取上清進行發(fā)光測定。按照試劑盒說明書和儀器操作說明對待測樣品進行發(fā)光值測定。

1.2.4實時定量PCR(Quantitative real-time reverse transcription PCR,qRT-PCR) 首先用RNA提取試劑盒提取總RNA后反轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后用以下引物進行qRT-PCR：miR-138-5p上游引物：5′-AGCTGGTGTTGTGAATCAGGCCG-3′，miR-138-5p下游引物：5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；HIF-1α上游引物：5′-TT GCTCATCAGTTGCCACTTCC-3′，HIF-1α下游引物：5′-AGCAATTCATCTGTGCT TTCATGTC-3′。按照試劑盒說明書進行檢測，用公式2-ΔΔCt計算相對表達量。

1.2.5蛋白印跡 各組待測細胞經(jīng)PBS清洗3次后加入含蛋白酶抑制劑的細胞裂解液提取總蛋白，100℃變性5 min。等量蛋白經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳分離后轉(zhuǎn)至PVDF膜。然后用5%的BSA封閉1 h，再加入抗HIF-1α的一抗，4℃過夜孵育。第2天加入辣根過氧化物酶標記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液后于凝膠成像儀進行曝光拍照，并統(tǒng)計灰度值計算相對表達量。

1.2.6CCK-8檢測細胞增殖能力 首先用培養(yǎng)液將CCK-8溶液稀釋到10%濃度，然后用上述CCK-8稀釋液將待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，最后檢測450 nm處吸光值，計算細胞增殖倍數(shù)。

1.2.7流式細胞術(shù)分析細胞凋亡 收集各組待測細胞后用PBS洗滌3次，再用1×Binding buffer將細胞制成1×106個/ml的懸液。然后加入Annexin V-fluorescein isothiocyanate (FITC)，避光，輕輕地混勻，室溫孵育10 min。再加入碘化丙啶(Propidium Iodide，PI)，避光，室溫孵育5 min。最后利用流式細胞儀對染色的細胞進行檢測。

1.2.8Transwell檢測細胞侵襲能力 首先用無血清的培養(yǎng)液將各組待測細胞制成細胞密度為1×106個/ml的懸液，并將上述細胞懸液加入鋪有人工基底膜的Transwell的上室中，同時在下室中加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基。37℃培養(yǎng)24 h。然后用0.5%的結(jié)晶紫對上室底部細胞進行染色，并用棉簽將上室內(nèi)側(cè)的細胞除去。顯微鏡下觀察并統(tǒng)計細胞數(shù)量。

1.2.9劃痕實驗分析細胞遷移能力 將各組待測細胞制成1×106個/ml的細胞懸液，加入6孔板中。過夜培養(yǎng)至形成單層細胞。然后在單層細胞上用10 μl 的槍頭劃橫線，PBS洗3次，洗去因劃痕而脫落的細胞。顯微鏡下拍照測量劃痕寬度。培養(yǎng)24 h后再取出拍照測量劃痕寬度，計算劃痕愈合率。

1.3統(tǒng)計學分析 用SPSS16.0軟件進行統(tǒng)計學分析，兩兩比較用獨立的t檢驗。P<0.01表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1miR-138-5p靶向HIF-1α 通過生物信息學預測發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可靶向HIF-1α。利用熒光素酶實驗進一步驗證miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系。圖1顯示， HIF-1α野生型序列中與miR-138-5p互補的序列ACCAGC突變?yōu)閁GGUCG后，HIF-1α野生型與HIF-1α突變型細胞中熒光素酶活性不存在統(tǒng)計學差異。在HIF-1α野生型中轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后熒光素酶活性降低(P<0.01)。但在HIF-1α突變型細胞中轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后熒光素酶活性無明顯變化。上述結(jié)果表明，miR-138-5p可靶向HIF-1α。

2.2miR-138 mimic對人腎癌GRC-1細胞HIF-1α的mRNA水平的影響 向人腎癌GRC-1細胞轉(zhuǎn)染miR-138 mimic后，通過qRT-PCR檢測miR-138表達及HIF-1α的mRNA水平。如圖2所示，miR-138 mimic組miR-138表達高于對照組(P<0.01)。miR-138 mimic組HIF-1α的mRNA水平低于對照組(P<0.01)。由此可見，miR-138 mimic可降低人腎癌GRC-1細胞HIF-1α的mRNA水平。

2.3miR-138對人腎癌GRC-1細胞HIF-1α的蛋白水平的影響 為進一步分析miR-138表達與HIF-1α表達間的關(guān)系，將miR-138 mimic和pc-HIF-1α分別或者同時轉(zhuǎn)入GRC-1細胞后通過蛋白印跡檢測HIF-1α的蛋白水平。由圖3可知，miR-138 mimic組HIF-1α的蛋白水平低于對照組(P<0.01)。與對照組相比，pc-HIF-1α組HIF-1α的蛋白水平上升(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組HIF-1α的蛋白水平低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說明，miR-138負向調(diào)控人腎癌GRC-1細胞HIF-1α的表達。

2.4miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞增殖能力的影響 利用CCK-8檢測細胞增殖能力， 分析miR-138-5p 靶向HIF- 1α對人腎癌GRC-1細胞增殖能力的影響。圖4顯示，miR-138 mimic組細胞增殖倍數(shù)低于對照組(P<0.01)。與對照組相比，pc-HIF-1α組細胞增殖倍數(shù)升高(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組細胞增殖倍數(shù)低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說明，miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細胞增殖能力。

圖1 熒光素酶實驗驗證miR-138-5p與HIF-1α的靶向關(guān)系Fig.1 Luciferase reporter assay verified targeting relationship between miR-138-5p and HIF-1α

圖2 qRT-PCR檢測miR-138表達及HIF-1α的mRNA水平Fig.2 Expression of miR-138 and mRNA level of HIF-1α were detected by Quantitative Real-time PCR

2.5miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞凋亡的影響 為分析miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞凋亡的影響，通過流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡。如圖5所示，miR-138 mimic組細胞凋亡率高于對照組(P<0.01)。與對照組相比，pc-HIF-1α組細胞凋亡率下降(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組細胞凋亡率高于pc-HIF-1α組(P<0.01)。由此可見，miR-138-5p靶向HIF-1α可提高人腎癌GRC-1細胞凋亡能力。

2.6miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞侵襲能力的影響 利用Transwell檢測細胞侵襲能力，分析miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞侵襲能力的影響。由圖6可知，miR-138 mimic組侵襲細胞數(shù)量低于對照組(P<0.01)。與對照組相比，pc-HIF-1α組侵襲細胞數(shù)量升高(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組侵襲細胞數(shù)量低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。上述結(jié)果表明，miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細胞侵襲能力。

圖3 蛋白印跡檢測HIF-1α的蛋白水平Fig.3 Protein levels of HIF-1α were detected by Western blot

圖4 CCK-8檢測細胞增殖能力Fig.4 Cell proliferation was detected by CCK-8

2.7miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞遷移能力的影響 通過劃痕實驗檢測細胞遷移能力，分析miR-138-5p靶向HIF-1α對人腎癌GRC-1細胞遷移的影響。圖7顯示，miR-138 mimic組劃痕愈合率低于對照組(P<0.01)。與對照組相比，pc-HIF-1α組劃痕愈合率上升(P<0.01)。mimic+pc-HIF-1α組劃痕愈合率低于pc-HIF-1α組(P<0.01)。以上結(jié)果說明，miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱人腎癌GRC-1細胞遷移能力。

圖5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡Fig.5 Cell apoptosis was detected by flow cytometry

圖6 Transwell檢測細胞侵襲能力Fig.6 Transwell assay for cell invasion

圖7 劃痕實驗檢測細胞遷移能力Fig.7 Cell migration was detected by scratch test

3 討論

腎癌的傳統(tǒng)治療方法主要包括化療、根治性腎切除術(shù)、免疫療法等[8-10]。而在過去的15年里，隨著原發(fā)性腫瘤外科治療的進展和對腎癌分子生物學和基因組學的認識增加，腎癌治療研究發(fā)生了很大的變化，靶向治療在腎癌治療中受到了廣泛關(guān)注[11-13]。尋找合適的靶點對靶向治療至關(guān)重要。越來越多的研究表明MicroRNAs在細胞增殖、凋亡、侵襲和遷移方面發(fā)揮著重要作用，具有成為靶向治療靶點的潛能。

細胞增殖的失控是癌細胞的主要特征之一，大量文獻報道MicroRNAs具有抗癌細胞增殖的功能。有數(shù)據(jù)顯示miR-106a*可靶向IRS-2減弱腎癌A498 細胞增殖[14]。有研究表明miR-335可通過負向調(diào)控BCL-W表達降低腎癌786-O 和 CaKi-1細胞增殖[15]。Xu等[16]發(fā)現(xiàn)miR-203可通過靶向FGF2抑制腎癌786-O細胞增殖。據(jù)報道m(xù)iR-138-5p可靶向FOXC1減弱胰腺癌細胞增殖[17]。另外，有研究發(fā)現(xiàn)miR-138-5p靶向PD-L1可抑制結(jié)腸直腸癌細胞增殖[18]。本文結(jié)果顯示，miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細胞增殖能力。

癌細胞常常會出現(xiàn)異常的細胞凋亡，越來越多的研究表明MicroRNAs在誘導癌細胞凋亡方面發(fā)揮著積極作用。據(jù)報道在腎癌ACHN和786-O細胞中miR-145可靶向ANGPT2和 NEDD9促進細胞凋亡[19]。有研究顯示miR-646可靶向NOB1增加腎癌786-O細胞凋亡[20]。Ma等[21]發(fā)現(xiàn)miR-185可靶向VEGFA誘導腎癌ACHN和786-O細胞凋亡。有數(shù)據(jù)顯示miR-138-5p可靶向SIRT1促進宮頸癌細胞凋亡[22]。據(jù)報道在視網(wǎng)膜母細胞瘤細胞中miR-138-5p可靶向PDK1增加細胞凋亡[23]。與前人結(jié)果類似，本研究結(jié)果顯示，miR-138-5p靶向HIF-1α可提高人腎癌GRC-1細胞凋亡。

癌細胞的侵襲能力在癌癥進程中至關(guān)重要，大量數(shù)據(jù)表明MicroRNAs具有調(diào)節(jié)癌細胞侵襲的功能。有研究發(fā)現(xiàn)miR-141可通過調(diào)控EphA2表達抑制腎癌786-O和SN12-PM6細胞侵襲[24]。有數(shù)據(jù)顯示miR-34a可靶向CD44降低腎癌ACHN，786-O 和SN12PM6細胞侵襲[25]。據(jù)報道m(xù)icroRNA-145可靶向MMP-11減弱腎癌786-O 和A498細胞侵襲[26]。研究表明miR-138-5p靶向Survivin可降低膀胱癌細胞侵襲[27]。另外，Zhuang等[28]發(fā)現(xiàn)miR-138-5p還可直接靶向ΔNp63抑制口腔鱗狀細胞癌細胞侵襲。本文結(jié)果顯示，miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱人腎癌GRC-1細胞侵襲能力。

細胞遷移能力的提高是癌癥擴散轉(zhuǎn)移的基礎，越來越多的文獻報道MicroRNAs在癌細胞遷移方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。有研究發(fā)現(xiàn)miR-204可通過負向調(diào)控SOX4降低腎癌786-O和A498細胞遷移[29]。有數(shù)據(jù)顯示，miR-182可靶向IGF1R減弱腎癌Caki-1細胞遷移[30]。有研究表明在胃癌細胞中miR-138-5p可靶向EGFR降低細胞遷移[31]。Xiao等[32]發(fā)現(xiàn)miR-138-5p可靶向YAP1抑制非小細胞肺癌細胞遷移。據(jù)報道在骨肉瘤細胞中miR-138-5p還可通過靶向EZH2減弱細胞遷移[33]。本文結(jié)果顯示，miR-138-5p靶向HIF-1α可降低人腎癌GRC-1細胞遷移能力。

本研究表明，在人腎癌GRC-1細胞中，miR-138-5p可靶向HIF-1α；miR-138負向調(diào)控HIF-1α的表達；miR-138-5p靶向HIF-1α可減弱細胞增殖、侵襲和遷移能力；并促進細胞凋亡。下一步計劃在腎癌動物模型中研究miR-138-5p對腎癌發(fā)生發(fā)展的影響，為開發(fā)有效的腎癌治療方法奠定基礎。