崔東娟 劉 濤 趙艷紅

(商丘醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校，基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部解剖學(xué)教研室，商丘 476000)

肝纖維化是病毒性肝炎、藥物性肝損傷、脂肪肝等多種慢性肝病的共同病理過(guò)程，是指在各種致病因素的作用下，肝臟發(fā)生損傷及炎性反應(yīng)，造成肝細(xì)胞壞死和凋亡，細(xì)胞外基質(zhì)分泌增加，使細(xì)胞外基質(zhì)的生產(chǎn)與溶解之間失去平衡，導(dǎo)致過(guò)多的細(xì)胞外基質(zhì)在肝內(nèi)沉積而引發(fā)的一系列病理改變，可發(fā)展為肝硬化甚至肝腫瘤[1]。肝纖維化的發(fā)病率和死亡率都很高，且呈現(xiàn)逐年上升的趨勢(shì)，已成為一個(gè)亟待解決的醫(yī)學(xué)問(wèn)題[2,3]。有效抑制肝纖維化的發(fā)生和發(fā)展對(duì)肝病的治療具有重要意義。越來(lái)越多的研究表明植物提取物在各類疾病的治療中具有積極作用，黃酮類化合物是水果、蔬菜、茶葉和可可中主要的活性植物成分之一，在肝保護(hù)、過(guò)敏反應(yīng)和病毒感染等方面發(fā)揮著重要作用。香葉木素是黃酮苷香葉木甙的糖苷配基，發(fā)現(xiàn)于金合歡和橄欖葉中，具有多種藥理學(xué)活性，如抗癌、抗菌、抗氧化及抗炎等[4]。但關(guān)于香葉木素在肝纖維化中的作用研究還比較匱乏。本研究主要目的是探究香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化的影響及其分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及主要試劑 7周齡SD大鼠購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。CCl4購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。香葉木素(HPLC≥98%)、蘇木素-伊紅(Hematoxylin-eosin，HE)染色液和改良型Masson 三色染色液購(gòu)自Solarbio公司。脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記(Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick labeling，TUNEL)細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司?？辜?xì)胞增殖核抗原-67(Antigen identified by monoclonal antibody，Ki-67)抗體、抗含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD 樣受體家族3 (NOD-like receptor family， pyrin domain containing 3，NLRP3)抗體、抗凋亡相關(guān)微粒蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing CARD，ASC)抗體、抗Caspase 1抗體和抗白細(xì)胞介素(Interleukin，IL)-1β抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司。

1.2方法

1.2.1動(dòng)物分組及藥物處理 香葉木素用DMSO溶解配制成1 mg/ml的溶液待用。實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為4組：對(duì)照組；香葉木素(DM)組；CCl4組；CCl4+ DM組。首先CCl4組和CCl4+ DM組皮下注射40%的CCl4橄欖油溶液(1.5 ml/kg)，2周一次連續(xù)8周，對(duì)照組和DM組皮下注射等量的橄欖油。上述處理的倒數(shù)第6天開(kāi)始，DM組和CCl4+ DM組每天腹腔注射香葉木素(20 mg/kg)，對(duì)照組和CCl4組用生理鹽水代替。

1.2.2HE染色 首先將肝臟左葉用4%的多聚甲醛于4°C下固定24 h。PBS清洗3次后用30%、50%和70%的酒精梯度脫水，每個(gè)梯度脫水10 min。去除酒精后，組織塊于脫水機(jī)中脫水，然后進(jìn)行石蠟包埋和切片。最后按照HE染色液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行HE染色。光鏡下觀察肝臟組織病變情況。

1.2.3免疫組化染色 各組大鼠肝臟組織的石蠟切片經(jīng)脫蠟再水化后，用1%的Triton-100通透15 min，再用3%的H2O2處理15 min。經(jīng)5%的羊血清封閉30 min后再加入抗Ki67抗體(0.5 μg/ml)，4℃過(guò)夜孵育，第二天加入二抗，于37℃孵育30 min。最后進(jìn)行染色封片觀察。

1.2.4TUNEL 按照試劑盒說(shuō)明書(shū)首先對(duì)石蠟切片進(jìn)行預(yù)處理，石蠟切片依次進(jìn)行二甲苯脫蠟和梯度乙醇水化，再用蛋白酶K于20～37℃處理15～30 min。PBS漂洗3次后用3%的H2O2于室溫孵育20 min，隨后PBS清洗3次。然后進(jìn)行生物素標(biāo)記，顯色，蘇木素復(fù)染，梯度乙醇脫水，二甲苯透明。最后中性樹(shù)膠封片，顯微鏡下觀察拍照，細(xì)胞核呈棕色顆粒的為凋亡細(xì)胞。

1.2.5Masson染色 石蠟切片常規(guī)脫蠟至水后，按照改良型Masson 三色染色液說(shuō)明書(shū)進(jìn)行染色。首先切片放入Bouin 液于37℃的溫箱內(nèi)進(jìn)行媒染2 h，水沖洗至切片上的黃色消失。然后進(jìn)行天青石藍(lán)染色液滴染，Mayer 蘇木素染色液滴染，酸性乙醇分化，麗春紅品紅染色液滴染。最后蒸餾水稍漂洗后磷鉬酸溶液處理約10 min后于苯胺藍(lán)染色液染色5 min，弱酸溶液處理后乙醇脫水，二甲苯透明，封片，顯微鏡下觀察拍照，膠原纖維呈藍(lán)色，肌纖維、胞質(zhì)、纖維素、角蛋白和紅細(xì)胞呈紅色，胞核呈藍(lán)褐色。

1.2.6蛋白印跡 首先用PBS將待測(cè)肝臟組織細(xì)胞清洗3次后，加入含蛋白酶抑制劑的裂解液進(jìn)行總蛋白提取，100℃變性5 min。然后取等量(30 μg)蛋白進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳分離并轉(zhuǎn)至PVDF膜，5%的BSA封閉1 h后加入相應(yīng)的一抗：抗NLRP3抗體(1 μg/ml)，抗ASC抗體(1 μg/ml)，抗Caspase 1抗體(12 μg/ml)，抗IL-1β抗體(0.2 μg/ml)，4℃過(guò)夜孵育。第二天加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1.5 h。最后加入發(fā)光液置于凝膠成像儀中，進(jìn)行曝光拍照，統(tǒng)計(jì)灰度值后計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 用SPSS16.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較用獨(dú)立的t檢驗(yàn)。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響 利用HE染色觀察香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織病變的影響。如圖1所示，對(duì)照組和DM組肝臟組織細(xì)胞排列規(guī)則有序，無(wú)充血及壞死等病理學(xué)變化。CCl4組出現(xiàn)肝臟組織細(xì)胞排列紊亂無(wú)序、充血、細(xì)胞質(zhì)空泡化、肝細(xì)胞壞死等病理變化。CCl4+DM組沒(méi)有觀察到明顯的肝臟組織病變。由此可見(jiàn)，香葉木素可減輕CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織病變。

2.2香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞增殖的影響 通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)肝臟組織中增殖相關(guān)蛋白Ki67的表達(dá)，分析香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞增殖的影響。圖2顯示，CCl4組Ki67的表達(dá)明顯低于對(duì)照組(P<0.05)。CCl4+DM組Ki67的表達(dá)明顯高于CCl4組(P<0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明，香葉木素可增強(qiáng)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞增殖。

2.3香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響 利用TUNEL染色分析香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞凋亡的影響。由圖3可知，CCl4組細(xì)胞凋亡明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與CCl4組相比，CCl4+DM組細(xì)胞凋亡明顯下降P<0.05)。上述結(jié)果表明，香葉木素可減弱CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠細(xì)胞凋亡。

2.4香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化的影響 通過(guò)Masson三色染色分析香葉木素對(duì)Cl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化的影響。如圖4所示，對(duì)照組和DM組未見(jiàn)明顯的肝纖維化現(xiàn)象，CCl4組肝纖維化程度十分嚴(yán)重，CCl4+DM組肝纖維化現(xiàn)象得到明顯改善。以上結(jié)果說(shuō)明，香葉木素可緩解CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化。

圖1 HE染色觀察肝臟組織病變(×200)Fig.1 Pathological changes of liver tissues were observed by HE staining (×200)

圖2 免疫組化染色檢測(cè)Ki67表達(dá)Fig.2 Expression of Ki67 was detected by immunohisto-chemical staining

圖3 TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡Fig.3 Apoptosis was measured by TUNEL

圖4 Masson染色觀察肝纖維化(×200)Fig.4 Hepatic fibrosis was observed by masson staining (×200)

圖5 蛋白印跡檢測(cè)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)Fig.5 Expression of NLRP3 inflammasome related protein was detected by Western blot

2.5香葉木素對(duì)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白表達(dá)的影響 為探究香葉木素可改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化的分子機(jī)制，蛋白印跡檢測(cè)NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1(活化型)和IL-1β的表達(dá)。圖5顯示，CCl4組NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β的表達(dá)明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。與CCl4組相比，CCl4+DM組NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表達(dá)明顯下降(P<0.05)。由此可見(jiàn)，香葉木素可降低CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體信號(hào)通路活化。

3 討論

目前治療肝纖維化的主要策略包括：減少原發(fā)性疾病、抑制肝細(xì)胞凋亡、減弱炎癥反應(yīng)[5,6]。前人研究表明類固醇物質(zhì)、膽烷酸、內(nèi)源性大麻素等物質(zhì)有利于肝纖維化的治療，但還存在耐藥性強(qiáng)、效果不顯著等缺陷，因此，迫切需要開(kāi)發(fā)新藥來(lái)治療肝纖維化[7]。越來(lái)越多的文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物在抗纖維化方面發(fā)揮著積極作用[8,9]。

各種肝病中常常會(huì)出現(xiàn)肝臟組織病變，據(jù)報(bào)道許多植物提取物具有改善肝臟組織病變的功效。有數(shù)據(jù)顯示香茅草提取物可改善H2O2誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織充血、浸潤(rùn)、細(xì)胞質(zhì)空泡化和肝細(xì)胞變性等病變[10]。有研究表明沒(méi)食子酸、黃連素和波棱瓜提取物均可減輕CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝臟組織脂肪變性，胞質(zhì)空泡化及肝細(xì)胞壞死等病變現(xiàn)象[11-13]。另外，大蒜素可減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝臟組織病變[14]。本研究結(jié)果顯示，香葉木素可改善CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織細(xì)胞排列不規(guī)則、充血、細(xì)胞質(zhì)空泡化、肝細(xì)胞壞死等病理變化。

肝細(xì)胞凋亡的增加是肝纖維化進(jìn)程中的常見(jiàn)癥狀[15]。大量文獻(xiàn)報(bào)道植物提取物可調(diào)控細(xì)胞凋亡。有研究表明沒(méi)食子酸具有減弱CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的功能[16]。有數(shù)據(jù)顯示香葉木素可抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的急性腎損傷小鼠腎臟細(xì)胞凋亡的上升[17]。在阿霉素誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜損傷大鼠中，香葉木素可減弱視網(wǎng)膜組織細(xì)胞凋亡的增強(qiáng)[18]。Yang等[19]發(fā)現(xiàn)香葉木素還可降低內(nèi)毒素誘導(dǎo)的急性肝衰竭小鼠肝臟組織細(xì)胞凋亡的增加。本文結(jié)果顯示，香葉木素可增強(qiáng)CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝臟組織Ki67表達(dá)，降低細(xì)胞凋亡。

越來(lái)越多的研究表明多種植物提取物具有緩解肝纖維化的作用。據(jù)報(bào)道在高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖小鼠中，桑葉提取物可降低肝纖維化[20]。有研究發(fā)現(xiàn)食用辣椒素可抑制膽管結(jié)扎或CCl4誘導(dǎo)的小鼠肝纖維化[21]。有數(shù)據(jù)顯示滿天星異葒草苷和蝦仔花提取物都具有減輕CCl4誘導(dǎo)的大鼠肝纖維化的功效[22，23]。本研究結(jié)果顯示，香葉木素可緩解CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化。

NLRP3炎性小體在各類疾病中具有重要作用，NLRP3炎性小體的活化會(huì)導(dǎo)致肝纖維化的加劇[24-26]。研究表明許多植物提取物可調(diào)節(jié)NLRP3炎性小體活性。Wang等[27]發(fā)現(xiàn)在葡聚糖硫酸鈉誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠中，槐耳提取物可降低NLRP3炎性小體活性發(fā)揮保護(hù)作用。有數(shù)據(jù)顯示菊苣提取物可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體活性起到抗糖尿病的功效[28]。據(jù)報(bào)道野風(fēng)仙花提取物可抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠NLRP3表達(dá)的上升，降低NLRP3炎性小體活性[29]。另外，香葉木素也可抑制脂多糖誘導(dǎo)的急性肺損傷小鼠NLRP3和ASC表達(dá)的升高，抑制NLRP3炎性小體活性[30]。本文結(jié)果顯示，香葉木素可減弱CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠NLRP3炎性小體信號(hào)通路活化。

綜上所述，在CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠中，香葉木素可減輕肝臟組織病變，增強(qiáng)細(xì)胞增殖，降低細(xì)胞凋亡，改善肝纖維化，減弱NLRP3炎性小體相關(guān)蛋白NLRP3、ASC、Caspase 1和IL-1β表達(dá)。香葉木素可通過(guò)抑制NLRP3炎性小體信號(hào)通路緩解CCl4誘導(dǎo)的肝損傷大鼠肝纖維化。下一步將計(jì)劃研究香葉木素對(duì)其他因素導(dǎo)致的肝纖維化的影響。