張躍軍 蔣傳好 肖鵬程 劉佳強 彭俊 吳移謀

(株洲市中心醫(yī)院臨床檢驗中心，株洲 412007)

梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)是導致人類梅毒的病原微生物，其危害極大，不僅可以引起梅毒，而且是增加艾滋病風險的重要病原體，因此研究Tp的致病機制，有利于提高對該病的防控水平。Tp難以體外培養(yǎng)，因此目前對其致病機制的了解有限。隨著Tp全基因組測序的發(fā)展，Tp的主要致病物質(zhì)如外膜蛋白、鞭毛蛋白、透明質(zhì)酸酶的作用逐步受到重視。研究表明，Tp感染后的炎癥反應是導致固有免疫系統(tǒng)異常的主要因素[1]。Tp0917是本課題組前期克隆表達出的一種膜蛋白，前期研究表明，Tp0971具有較好的免疫原性[2]，同時也能激活TLR信號轉(zhuǎn)導通路而誘導促炎細胞因子的分泌[3]，但其是否還具有其他的致炎機制目前仍不明確。因此本研究旨在進一步探討Tp0971所激活的信號通路，并探討其在TNF-α和IL-1β分泌中的作用。

1 材料與方法

1.1材料 Tp0971重組蛋白由本課題組構(gòu)建并純化[3]；Detoxi-GelTM內(nèi)毒素去除膠為Thermo產(chǎn)品；RPMI1640培養(yǎng)基購自Invitrogen； TNF-α和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自深圳欣博盛生物科技有限公司； 磷酸化ERK1/2、JNK1/2和p38抗體購自Cell Signaling；NF-κB p65多克隆抗體購自Santa Cruz；U0126、SP600125和SB203580購自Merk。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng)與刺激 人單核細胞系THP-1首先用含10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，實驗前24 h更換為無血清培養(yǎng)基，隨后加入終濃度為160 nmol/L的PMA使其誘導分化為巨噬細胞。根據(jù)不同的實驗目的，細胞加入已去除內(nèi)毒素的Tp0971重組蛋白刺激不同時間后用于下一步研究。

1.2.2ELISA檢測TNF-α和IL-1β分泌 獲取Tp0971刺激結(jié)束后的巨噬細胞上清，4℃低速離心5 min 后，取100 μl待測樣品至預包被有TNF-α或IL-1β的酶標孔中，37℃孵育2 h。結(jié)束后加入一抗工作液，37℃下繼續(xù)避光孵育90 min。隨后充分洗滌以去除殘留一抗，并加入生物素標記二抗工作液繼續(xù)孵育30 min，最后依次加入顯色劑和終止液。置于酶標儀下獲取其吸光值，并根據(jù)試劑盒提供的方法繪制標準曲線，計算出上清液中TNF-α或IL-1β的濃度。

1.2.3實時定量PCR檢測TNF-α和IL-1β mRNA的表達 采用Qiagen公司提供的RNA提取試劑盒提取細胞總RNA。隨后將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實時定量PCR分析TNF-α和IL-1β mRNA的表達。本文所用的引物如下：TNF-α：forward 5′-TGG TGG TCT TGT TGC TTA AAG TTC-3′，reverse 5′-CGA ACA TCC AAC CTT CCC AAA C-3′；IL-1β：forward 5′-CGG CCA CAT TTG GTT CTA AGA-3′，reverse 5′-AGG GAA GCG GTT GCT CAT C-3′；GAPDH：forward 5′-CCACTCCTCCACCTTTGAC-3′，reverse 5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。反應于LightCycle 96上進行擴增，結(jié)果用2-ΔΔCt表示。

1.2.4Western blot檢測 巨噬細胞處理結(jié)束后，棄培養(yǎng)上清并用無菌PBS漂洗1次。加入胰酶消化使細胞從培養(yǎng)板中脫落，無菌PBS漂洗2次后，加入100 μl 含蛋白酶和磷酸酶的SDS上樣緩沖液裂解細胞，并采用Bradford法測定細胞總蛋白的濃度。隨后取20 μl總蛋白用于SDS-PAGE，電泳結(jié)束后采用半干轉(zhuǎn)印法將其轉(zhuǎn)印至PVDF膜上，經(jīng)過封閉、孵育抗體后，采用ECL法發(fā)光、顯影。

2 結(jié)果

2.1不同濃度Tp0971蛋白誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β 陰性對照組TNF-α和IL-1β分泌水平很低。采用0.1、1.0和10.0 μg/ml Tp0971刺激24 h后，細胞上清中TNF-α和IL-1β水平顯著增高(圖1A)。為排除Tp0971蛋白在表達與純化過程中潛在的內(nèi)毒素污染，Tp0971使用100 μg/ml多黏菌素B預處理4 h，隨后ELISA檢測TNF-α和IL-1β的分泌水平，結(jié)果顯示多黏菌素B處理對細胞因子的分泌無影響(圖1B)。

2.2Tp0971誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β依賴持續(xù)的轉(zhuǎn)錄與翻譯 實時定量PCR結(jié)果顯示，巨噬細胞未刺激時，TNF-α和IL-1β mRNA表達水平極低。而不同濃度Tp0971刺激后，隨著濃度的遞增，mRNA水平逐漸增高。當給予10 μg/ml轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(ActD)預處理細胞后，TNF-α和IL-1β mRNA表達水平明顯受到抑制(圖2A)。同時，給予翻譯抑制劑放線菌酮(CHX)處理后，TNF-α和IL-1β的分泌明顯降低(圖2B)。

圖1 Tp0971蛋白誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1βFig.1 Tp0971 induces macrophages to secrete TNF-α and IL-1β

圖2 轉(zhuǎn)錄與翻譯抑制劑對Tp0971誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β的影響Fig.2 Effects of transcription and translation inhibitors on Tp0971 induced TNF-α and IL-1β secretion in macrophages

圖3 Tp0971經(jīng)ERK1/2、JNK1/2和p38誘導TNF-α和IL-1β分泌Fig.3 Tp0971 induces secretion of TNF-α and IL-1β by ERK1/2,JNK1/2 and p38

2.3Tp0971經(jīng)ERK1/2、JNK1/2和p38誘導TNF-α和IL-1β分泌 10 μg/ml Tp0971刺激巨噬細胞30 min后即可誘導ERK1/2、JNK1/2和p38磷酸化，60 min后達到峰值。而細胞內(nèi)總ERK1/2、JNK1/2和p38無明顯變化(圖3A)。為了證實ERK1/2、JNK1/2和p38在介導TNF-α和IL-1β分泌中的作用，本研究采用30 μmol/L ERK1/2、JNK1/2和p38抑制劑U0126、SP600125和SB203580預處理細胞30 min，結(jié)果顯示TNF-α和IL-1β分泌明顯減少(圖3B)。

2.4Tp0971激活NF-κB誘導TNF-α和IL-1β分泌 Tp0971處理后提取細胞核蛋白用于Western blot分析。結(jié)果顯示，10 μg/ml Tp0971處理60 min后，細胞核中p65亞基的表達水平顯著增多。而細胞首先采用30 μmol/L ERK1/2、JNK1/2和p38抑制劑U0126、SP600125和SB203580預處理后，p65的含量明顯減少(圖4A)。采用10～25 μmol/L NF-κB抑制劑PDTC預處理細胞后，TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少(圖4B)。

圖4 Tp0971經(jīng)NF-κB誘導TNF-α和IL-1β分泌Fig.4 Tp0971 induces TNF-α and IL-1β secretion by activation of NF-κB

3 討論

Tp是迄今為止無法在體外培養(yǎng)的病原微生物，感染后其表面的膜蛋白對宿主的固有免疫系統(tǒng)具有很強的調(diào)控作用，因此被認為是Tp重要的毒力因子[4,5]。Tp0971是本課題組前期克隆表達的一種膜蛋白，主要位于細胞外膜[6,7]，在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)對于Tp感染后，可在TLR2受體的介導下誘導促炎細胞因子IL-8、IL-6和IL-1β的分泌[3]。在本研究中，我們對其機制進行了進一步探討。本研究發(fā)現(xiàn)，和課題組鑒定的其他脂蛋白一樣，Tp0971也能誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，其分泌水平與Tp0971呈明顯的劑量依賴性關(guān)系。為了在轉(zhuǎn)錄水平檢測其表達，我們分別采用轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌素D(ActD)或翻譯抑制劑放線菌酮(CHX)處理細胞，結(jié)果顯示ActD和CHX處理后，均可顯著下調(diào)細胞因子的分泌，這表明Tp0971誘導TNF-α和IL-1β的分泌依賴于持續(xù)的轉(zhuǎn)錄和翻譯。TNF-α和IL-1β等促炎細胞因子的生物學功能具有多效性：一方面能在早期激活固有免疫系統(tǒng)從而發(fā)揮對Tp的清除作用，但另一方面TNF-α和IL-1β也可反饋性影響其他細胞因子的分泌。對于Tp感染后，產(chǎn)生的細胞因子眾多，機體的炎癥反應結(jié)局無疑最終取決于所有細胞因子和免疫細胞之間最終效應。

研究表明，MAPKs是TLR2信號通路中最重要的激酶，與炎癥反應密切相關(guān)。本研究也發(fā)現(xiàn)，Tp0971刺激后，可明顯促進JNK1/2、ERK1/2 和p38的磷酸化，其峰值位于60 min附近，這與LPS有所不同。其原因可能與其識別機制不同有關(guān)，因為機體TLR4受體在識別LPS時，往往伴有其他輔助受體如CD14、LBP等分子的參與[8]。而Tp0971是否也具有其他輔助受體的參與目前仍不明了。為了進一步明確MAPKs是否參與TNF-α和IL-1β的分泌，我們隨后采用了3種MAPKs抑制劑處理細胞，結(jié)果顯示這3 種抑制劑均可顯著下調(diào)TNF-α和IL-1β的分泌，表明其受JNK1/2、ERK1/2 和p38的調(diào)控。MAPKs激活后，可以激活下游多種核轉(zhuǎn)錄因子如NF-κB、AP-1和Sp1，其中以NF-κB最重要。細胞在靜息狀態(tài)下，NF-κB主要位于細胞漿內(nèi)。各種外源性因素如感染、氧化應激或凋亡刺激因素作用細胞后，可誘導NF-κB的p65亞基從細胞發(fā)生核轉(zhuǎn)位，從而導致其激活而誘導靶基因轉(zhuǎn)錄[9]。本研究證實，Tp0971處理巨噬細胞60 min后，細胞核內(nèi)p65表達水平明顯增多，而采用JNK1/2、ERK1/2 和p38抑制劑處理后，p65核轉(zhuǎn)位水平明顯受到抑制，這表明NF-κB位于MAPKs的下游。我們隨后用NF-κB特異抑制劑PDTC預處理巨噬細胞后，結(jié)果也發(fā)現(xiàn)TNF-α和IL-1β的分泌顯著減少。以上結(jié)果表明Tp0971誘導TNF-α和IL-1β的分泌與MAPKs/NF-κB通路的激活有關(guān)。

綜上所述，本研究證實了Tp0971膜蛋白能誘導巨噬細胞分泌TNF-α和IL-1β，這可能是Tp感染后炎癥反應的機制之一。同時，Tp0971膜蛋白也能激活MAPKs和NF-κB，這些蛋白激酶與核轉(zhuǎn)錄因子可能參與了TNF-α和IL-1β的分泌。盡管如此，TLR2和MAPKs之間的其他信號通路或其他核轉(zhuǎn)錄因子在Tp0971蛋白誘導細胞因子產(chǎn)生中的作用還有待進一步明確。有研究顯示，免疫系統(tǒng)的TLR4和TLR5也參與了識別Tp[10,11]。因此，對Tp致病相關(guān)分子的功能研究有利于進一步闡述Tp的致病機制并為疫苗開發(fā)奠定基礎(chǔ)。