陳千慧 郭旭雪 鄧霓姍 陳碩 何青 楊巧玉 王愛玲 丁續(xù)紅 余紅纓 聶漢祥

(武漢大學人民醫(yī)院呼吸內(nèi)科，武漢 430060)

恒定自然殺傷T細胞(invariant natural killer T cells,iNKT cells)是一類獨特的淋巴細胞亞群，通過分泌Th1和Th2細胞因子如IFN-γ和IL-4等，發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，并由此作為連接固有免疫和獲得性免疫的橋梁[1,2]。本課題組的初步研究顯示iNKT細胞可以增強哮喘小鼠的過敏性氣道炎癥反應(yīng)[3]，但機制尚不清楚。目前認為樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)可以誘導原始CD4+T細胞分化為Th2細胞，啟動和維持哮喘Th2反應(yīng)[4]。因此，本研究首先觀察過繼轉(zhuǎn)移iNKT細胞對哮喘小鼠肺樹突狀細胞(Lung dendritic cells,LDCs)表面分子和分泌細胞因子水平的影響；進一步以卵清白蛋白(OVA)致敏和激發(fā)CD1d-/--BALB/c小鼠(缺乏活化的iNKT細胞)，觀察缺乏iNKT細胞對小鼠LDCs表面分子和分泌細胞因子水平的影響，探討iNKT細胞與哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子表達水平的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 6周齡健康雌性野生型(Wild type,WT)BALB/c小鼠和CD1d-/--BALB/c小鼠分別購自武漢大學實驗動物中心和美國Jackson實驗室，無特定病原菌(Specific-Pathogen Free,SPF)環(huán)境飼養(yǎng)。

1.1.2主要試劑 雞卵清白蛋白(Ovalbumin,OVA,Grade,V)和氫氧化鋁凝膠購于美國Sigma公司；IL-12p70、IL-6、TNF-α和 IL-10 ELISA試劑盒購于美國eBioscience公司；PE-Cy5標記的TCR-β、PE-Cy5標記的F4/80、PE-Cy5標記的同型陰性對照、APC-Cy7標記的CD11c、PE標記的MHCⅡ、PE標記的CD40、PE標記的CD80、PE標記的CD86、固定劑和破膜劑均購于美國eBioscience公司；CD11c磁珠分選試劑盒和iNKT細胞磁珠分選試劑盒購于美國Miltenyi Biotec公司；Ⅰ型膠原酶購自Invitrogen公司；PE標記的未負載的小鼠CD1d四聚體和PBS-57/小鼠CD1d四聚體由美國國家衛(wèi)生研究院(National Institutes of Health)贈送。

1.2方法

1.2.1小鼠分組和哮喘模型的建立 24只WT-BALB/c小鼠按數(shù)字表法隨機分為正常對照組、哮喘組和過繼轉(zhuǎn)移組，每組8只；12只CD1d-/--BALB/c小鼠按隨機數(shù)字表法分為CD1d-/-對照組和CD1d-/-哮喘組，每組6只。建立小鼠哮喘模型的方法：哮喘組、過繼轉(zhuǎn)移組和CD1d-/-哮喘組小鼠于第0天和第7天腹腔注射含100 μg OVA和20 μg氫氧化鋁凝膠的PBS 200 μl致敏，隨后于第25、26和27天以1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉，使用含100 μg OVA的PBS 50 μl鼻腔滴入激發(fā)。正常對照組和CD1d-/-對照組小鼠在相應(yīng)時間內(nèi)腹腔注射等量的PBS并以PBS鼻腔滴入。

1.2.2小鼠iNKT細胞的制備及過繼轉(zhuǎn)移 取末次激發(fā)24 h后的哮喘小鼠的脾臟制備成脾單個核細胞懸液，采用磁珠分選法分選iNKT細胞(純度95%左右)，按試劑說明書操作。于第25天OVA激發(fā)前1 h，將iNKT細胞經(jīng)尾靜脈注射到過繼轉(zhuǎn)移組小鼠體內(nèi)，每只注入1×106個細胞。

1.2.3LDCs數(shù)量和表面分子表達水平的檢測 LDCs表面表達CD11c分子，不表達F4/80分子，因此以CD11c+F4/80-細胞標記LDCs[5]。為了檢測LDCs數(shù)量和表面分子表達水平，取各組小鼠右肺組織，充分切碎后Ⅰ型膠原酶消化，使用50 μm細胞濾網(wǎng)過濾獲得肺單細胞混懸液，以密度梯度離心法分離肺單細胞混懸液中單個核細胞(Mononuclear cells,MNCs)，調(diào)整細胞數(shù)為(5～10)×109L-1。取 100 μl于離心管中，加入抗小鼠 CD16/CD32抗體，避光，4℃，30 min；隨后加入PE-Cy5標記的F4/80和APC-Cy7標記的CD11c，于對照管中分別加入PE-Cy5和APC-Cy7標記的IgG1作為陰性對照，避光，4℃，50 min，PBS 液洗滌細胞1次后重懸細胞至0.5 ml PBS中，上機檢測，以CD11c+F4/80-細胞占MNCs的百分比表示LDCs數(shù)量。為了檢測LDCs表面分子的表達水平，取肺MNCs混懸液100 μl，首先加入PE-Cy5標記的F4/80和APC-Cy7標記的CD11c，避光，4℃，30 min；再分別加入PE標記的MHCⅡ、CD40、CD80和CD86，對照管加入PE標記的IgG1作為陰性對照，避光，4℃，30 min；PBS 液洗滌細胞1次后使用0.5 ml PBS重懸細胞，上機檢測，以MHCⅡ+、CD40+、CD80+和CD86+CD11c+F4/80-細胞占CD11c+F4/80-細胞(LDCs)的百分比表示LDCs表面分子的表達水平。

1.2.4LDCs的分離和培養(yǎng) 取末次激發(fā)24 h小鼠的左肺，制備肺MNCs混懸液，首先采用磁珠分選法分選肺MNCs混懸液中的CD11c+細胞；隨后使用流式細胞儀(Epics AltraⅡ)分選CD11c+F4/80-細胞，即為LDCs(純度 > 99%)。用含有10%熱滅活胎牛血清、2 mmol/L L-谷氨酰胺、0.1 mmol/L非必需基酸、50 μmol/L巰基乙醇、25 μg/ml慶大霉素和50 U/ml 青霉素的RPMI1640完全培養(yǎng)基重懸細胞于96孔板中，每孔LDCs 2×105個，在存在或不存在OVA(100 μg/ml)條件下體外培養(yǎng)72 h，收集培養(yǎng)上清液，-80℃保存，用于檢測細胞因子水平。

1.2.5LDCs培養(yǎng)上清液中細胞因子水平的檢測 采用ELISA法檢測LDCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和 IL-10水平，參考試劑說明書進行檢測。

2 結(jié)果

2.1過繼轉(zhuǎn)移iNKT細胞對哮喘小鼠LDCs數(shù)量、表面分子和分泌細胞因子水平的影響

2.1.1過繼轉(zhuǎn)移組與哮喘組、正常對照組小鼠LDCs數(shù)量的比較 過繼轉(zhuǎn)移組與哮喘組、正常對照組小鼠LDCs數(shù)量分別為(34.8±1.61)%、(28.2±3.91)%和(19.1±4.36)%，結(jié)果顯示過繼轉(zhuǎn)移組小鼠LDCs的數(shù)量與哮喘組、正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)，見圖1。

圖1 3組小鼠LDCs占肺MNCs的百分比比較Fig.1 Comparison of percentages of lung dendritic cells(LDCs)in lung mononuclear cells(MNCs)in three groups

2.1.2過繼轉(zhuǎn)移組與哮喘組、正常對照組小鼠LDCs表面分子表達水平的比較 以MHCⅡ+、CD40+、CD80+和CD86+CD11c+F4/80-細胞占CD11c+F4/80-細胞(LDCs)的百分比表示LDCs表面分子的表達水平，結(jié)果顯示過繼轉(zhuǎn)移組小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表達水平與哮喘組、正常對照組比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)。見圖2、表1。

2.1.3過繼轉(zhuǎn)移組與哮喘組、正常對照組小鼠LDCs分泌細胞因子水平的比較 過繼轉(zhuǎn)移組小鼠LDCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6和TNF-α水平明顯高于哮喘組(P<0.05或P<0.01)，但IL-10水平低于哮喘組(P<0.05或P<0.01)；正常對照組小鼠LDCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70、 IL-6、 TNF-α和IL-10可忽略不計(表2)。

圖2 3組小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表達水平的比較Fig.2 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in three groups

表1 3組小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86、CD80表達水平的比較Tab.1 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in three

2.2缺乏iNKT細胞對哮喘小鼠LDCs數(shù)量、表面分子和分泌細胞因子水平的影響

2.2.1CD1d-/-哮喘組與哮喘組、正常對照組、CD1d-/-對照組小鼠LDCs數(shù)量的比較 CD1d-/-哮喘組、哮喘組、正常對照組和CD1d-/-對照組小鼠LDCs數(shù)量分別為(22.3±4.32)%、(28.0±3.56)%、(19.1±4.36)%和(17.0±3.78)%，結(jié)果顯示CD1d-/-哮喘組小鼠LDCs數(shù)量明顯低于哮喘組(P<0.05)，但明顯高于CD1d-/-對照組(均P<0.05)，且CD1d-/-對照組小鼠LDCs數(shù)量與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見圖3。

2.2.2CD1d-/-哮喘組與哮喘組、正常對照組、CD1d-/-對照組小鼠LDCs表面分子表達的比較CD1d-/-哮喘組小鼠LDCs MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表達水平明顯低于哮喘組(P<0.05或P<0.01)，但哮喘組和CD1d-/-哮喘組小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表達水平明顯高于正常對照組和CD1d-/-對照組(P<0.05或P<0.01)，但CD1d-/-對照組小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表達水平與正常對照組比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，見表3、圖4。

2.2.3CD1d-/-哮喘組與哮喘組、正常對照組、CD1d-/-對照組小鼠LDCs分泌促炎性細胞因子水平的比較 哮喘組小鼠LDCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6和TNF-α水平明顯高于CD1d-/-哮喘組(P<0.05或P<0.01)，但IL-10水平低于CD1d-/-哮喘組(P<0.05)；正常對照組和CD1d-/-對照組小鼠LDCs培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10可忽略不計(表4)。

圖3 各組小鼠LDCs占肺MNCs的百分比比較Fig.3 Comparison of percentages of LDCs in lung MNCs in each group

圖4 各組小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表達水平的比較Fig.4 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in each group

表2 3組小鼠LDCs體外培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10水平的比較Tab.2 Comparison of levels of IL-12p70,IL-6,TNF-α and IL-10 in culture supernatant of LDCs in three /ml)

表3 各組小鼠LDCs表面分子MHCⅡ、CD40、CD86和CD80表達水平的比較(n=6或Tab.3 Comparison of expression levels of MHCⅡ,CD40,CD86 and CD80 on LDCs in each group(n=6 or

表4 各組小鼠LDCs體外培養(yǎng)上清液中IL-12p70、IL-6、TNF-α和IL-10水平的比較(n=6或Tab.4 Comparison of levels of IL-12p70,IL-6,TNF-α and IL-10 in culture supernatant of LDCs in each group(n=6 or

Note：1)P<0.05,compared with CD1d-/-asthma group;2)P<0.01,compared with CD1d-/-asthma group.

3 討論

iNKT細胞是非經(jīng)典主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子CD1d限制性的、能夠識別糖脂類抗原的一群特殊的天然T細胞亞群[6,7]。iNKT細胞可以通過識別來源于病原微生物的外源性脂類抗原或內(nèi)源性脂類抗原活化[1，2]。隨著iNKT細胞活化，可以快速分泌大量細胞因子，如IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、IL-13、IL-17、IL-21、IL-22、TNF和GM-CSF等，參與調(diào)節(jié)獲得性免疫反應(yīng)[8]。研究顯示iNKT細胞可以增強OVA誘導的哮喘小鼠過敏性氣道炎癥反應(yīng)[3]，但機制尚不清楚。本研究發(fā)現(xiàn)iNKT細胞可以增強哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子的表達水平，這可能與其增強哮喘小鼠氣道炎癥有關(guān)。

根據(jù)表面分子表達水平和分泌細胞因子類型與水平，DCs可以分為不成熟和成熟DCs兩個階段[9，10]。成熟DCs高表達表面分子，如CD80、CD86、CD40和MHCⅡ等，產(chǎn)生促炎性細胞因子，如IL-12、IL-6和TNF-α等，而免疫負相調(diào)節(jié)因子如IL-10分泌水平低；成熟DCs可以誘導原始T細胞增殖分化，因此，成熟DCs被認為是免疫原性DCs[10]。不成熟DCs表面分子表達水平低，不產(chǎn)生或產(chǎn)生少量促炎性細胞因子；不成熟DCs可以誘導T細胞無能，因此，不成熟DCs被認為是耐受原性DCs[10]。本研究發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠LDCs表面分子表達水平低，低分泌促炎性細胞因子如IL-12、IL-6和TNF-α，提示野生型小鼠LDCs是不成熟DCs。哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子表達水平明顯增高，但IL-10分泌水平明顯降低，提示哮喘小鼠LDCs是成熟DCs。為了探討iNKT細胞對哮喘小鼠LDCs成熟程度的影響，我們首先觀察iNKT細胞過繼轉(zhuǎn)移對哮喘小鼠LDCs表面分子和細胞因子表達水平的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)過繼轉(zhuǎn)移組小鼠LDCs的MHCⅡ、CD40、CD80、CD86表達水平以及LDCs體外培養(yǎng)上清液IL-12p70、IL-6、TNF-α水平明顯高于哮喘組，但IL-10分泌水平降低，提示過繼轉(zhuǎn)移iNKT細胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子的表達水平。由于CD1d基因敲除小鼠缺乏iNKT細胞活化必要的MHCⅠ類限制性元素而缺乏功能性iNKT細胞[11]，我們進一步觀察缺乏iNKT細胞對哮喘小鼠LDCs表面分子和細胞因子表達水平的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CD1d-/-哮喘組小鼠LDCs 表面分子如MHCⅡ、CD40、CD80、CD86的表達水平以及分泌促炎性細胞因子水平低于哮喘組，但IL-10分泌水平高于哮喘組，結(jié)果提示缺乏iNKT細胞可以降低哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子的表達水平。上述結(jié)果提示iNKT細胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子的表達水平，促進LDCs免疫原性成熟。目前認為LDCs是誘導哮喘Th2反應(yīng)的中心環(huán)節(jié)[4]，因此我們推測iNKT細胞增強OVA誘導的哮喘小鼠氣道炎癥可能與其增強LDCs的免疫原性成熟水平有關(guān)。

iNKT細胞促進LDCs免疫原性成熟的機制尚不清楚。目前認為DCs表達分子CD40與其配體CD40L(CD40 ligand)相互作用是誘導其成熟的機制之一[12]。本實驗結(jié)果顯示iNKT細胞可以增加哮喘小鼠LDCs表面CD40表達水平。研究顯示，抗原激活的iNKT細胞表面CD40L分子表達水平增高[13]。因此，我們推測iNKT細胞可能通過CD40-CD40L途徑促進LDCs成熟，但需進一步的研究。

綜上所述，iNKT細胞可以增強哮喘小鼠LDCs表面分子和促炎性細胞因子的表達水平，促進LDCs免疫原性成熟。