買合木提·克衣木，余世田，許輝

（1.新疆巴州動物疾病控制與診斷中心，庫爾勒 841000；2.西南大學(xué)動物科技學(xué)院，重慶 400715）

SNAP法（又稱雙流向酶聯(lián)免疫技術(shù)）是經(jīng)過美國分析化學(xué)家協(xié)會（AOAC）認證的抗生素檢測方法，是國際食品法典委員會（CAC）中抗生素殘留的標準檢測方法，并獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）認可[1]，也是目前我國抗生素殘留檢測使用的常規(guī)方法之一。該方法是一種免疫學(xué)的ELISA法，測定原理是將特定抗原類群作為靶子，使樣品中的抗原和內(nèi)置抗原標記物共同與固定包被抗體發(fā)生競爭反應(yīng)，通過酶與底物的顯色反應(yīng)，測定吸光值，判定結(jié)果陽性還是陰性。該法簡化了檢測過程，具有靈敏度高，操作簡單等特點[2]，為畜牧生產(chǎn)企業(yè)提供了一種快速、簡單和可靠的從源頭控制食品質(zhì)量安全的檢測方法。

1 SNAP法在檢測奶制品抗生素殘留中的應(yīng)用

抗生素一般是指致病微生物，包括細菌、霉菌、支原體和衣原體等。根據(jù)2017年的數(shù)據(jù)分析，全世界用于食品動物的抗生素到2030年將達到105.596t[3]。目前，在奶牛乳房炎的防治中，抗生素依然是首選的常規(guī)藥物。在嬰幼兒奶粉中也有抗生素檢出[4]，抗生素殘留對嬰幼兒的危害尤為嚴重，其主要危害表現(xiàn)為產(chǎn)生過敏反應(yīng)、引起細菌耐藥性、造成腸道環(huán)境紊亂和菌群失調(diào)[5]。牛乳中抗生素殘留的來源主要有兩個，一是用于治療奶牛疾病而使用的內(nèi)服或者外用抗生素在奶牛體內(nèi)經(jīng)循環(huán)代謝到達乳房并未及時排出，或者未按照抗生素使用規(guī)范規(guī)定的用量和停藥期等進行操作；二是不按照衛(wèi)生規(guī)范和操作規(guī)范給奶牛擠奶并向鮮乳中添加防腐用抗生素[6，7]。

丁潔等[8]通過SNAP法和國標TTC法(嗜熱鏈球菌抑制法)對牛奶中三種不同濃度的β內(nèi)酰胺藥物分別檢測。結(jié)果表明，SNAP法能夠在美國FDA安全濃度范圍內(nèi)檢測出極微量的β內(nèi)酰胺抗生素（2.0ng/mL 氨芐西林、1.0ng/mL青霉素鉀和1.0ng/mL頭孢匹林，F(xiàn)DA規(guī)定的安全濃度分別為氨芐西林10.0ng/mL、青霉素鉀5.0ng/mL、頭孢匹林2.0ng/mL），而國標TTC法在FDA規(guī)定的安全濃度以內(nèi)，陽性檢出率均為0。同時細菌干擾和凍融對SNAP法的檢測穩(wěn)定性和可靠性研究表明，在含有安全濃度的三種β內(nèi)酰胺藥物的奶樣中，添加3×106cfu/mL金黃色葡萄球菌和大腸桿菌對SNAP法檢測結(jié)果沒有影響，同時凍融處理對SNAP法檢測結(jié)果也沒有影響。王文輝等[9]的研究也表現(xiàn)出同樣的結(jié)果，但是SNAP法對氨基糖苷類抗生素并沒有表現(xiàn)出更高的靈敏度；對大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和磺胺類的檢測，在其最大殘留限量范圍內(nèi)不能陽性檢出，且其靈敏度低于TTC法；對氟喹諾酮類抗生素和氯霉素的檢測無效。

2014年，樊蘊秀[10]采用SNAP法和杯碟法對生乳進行了β-內(nèi)酰胺的檢測，結(jié)果顯示表明杯碟法能在較小的濃度（5U/mL）下檢測出β-內(nèi)酰胺殘留，而SNAP法在較小濃度（5U/mL）下可能表現(xiàn)出假陽性，需要杯碟法進行進一步的確認。Kneebone 等[11]也采用了SNAP法檢測了美國雀巢、荷蘭ELK和法國Regilait三家企業(yè)的五種奶制品，結(jié)果顯示，在歐盟和美國FDA規(guī)定的最大殘留限度內(nèi)對β內(nèi)酰胺抗生素擁有較好的檢測效果，并未出現(xiàn)假陽性和假陰性情況。Rama等[12]也得出相同結(jié)果，同時液相色譜法在殘留允許范圍內(nèi)能陽性檢出阿莫西林、青霉素G和鄰氯青霉素。

SNAP法在檢測山羊原料奶時，假陽性率僅有1%，同時乳品質(zhì)對檢測結(jié)果幾乎沒有影響[13]。SNAP法能在三聚氰胺濃度達到0.285ppm時檢測出所有陽性，最低檢測限度可以達到0.1ppm[14]。

通過數(shù)據(jù)庫檢索關(guān)鍵詞檢索，對有效檢索文獻中的數(shù)據(jù)匯總得表1。從結(jié)果可以看出，SNAP法與國標TTC法對比，在檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素時，表現(xiàn)出極高的靈敏度，且靈敏度高于TTC法。但對于β-內(nèi)酰胺類以外的抗生素，該方法并沒有表現(xiàn)出更高的靈敏度甚至完全無效。同時，SNAP法在比較低的濃度下也極易表現(xiàn)出假陽性，需要用杯碟法或液相色譜法等其他方法進一步輔助檢測。

2 SNAP法在檢測黃曲霉素中的應(yīng)用

霉變飼料中含有大量的黃曲霉素B1，B1是黃曲霉素中毒性最強、致癌性最強的一種。動物攝取黃曲霉素B1后，在肝臟細胞微粒體細胞色素P-450作用下，黃曲霉素B1會轉(zhuǎn)化為黃曲霉素M1，代謝進入乳中[19]。人食用后，極有可能引起肝癌，而且對嬰幼兒的危害可能更為嚴重[20]。付成平等[21]用SNAP法和高效液相色譜法對35個批次的生鮮奶、純牛奶進行了黃曲霉素M1的測定。SNAP法檢測結(jié)果中有7個樣品為陽性，對陽性樣品進行高效液相色譜定量分析，結(jié)果顯示黃曲霉素M1含量在0.116～0.302μg/L范圍，而SNAP法的檢測靈敏度為0.5μg/L。這說明，在檢測黃曲霉素殘留中，SNAP法存在報告假陽性的情況。

表1 SNAP法在檢測抗生素殘留中的應(yīng)用

在檢測黃曲霉素的方法中，薄層液相色譜是一種傳統(tǒng)的經(jīng)典方法[22]，同時酶聯(lián)免疫法是目前國際上采用的一種測定黃曲霉素的高效而科學(xué)的方法，目前主要利用酶聯(lián)免疫法檢測出可疑樣品，再用薄層色譜法進行確認，效果可以達到國際先進水平（靈敏度可達到0.1μg/L，變異系數(shù)為0.4%～2.6%）[23]。酶聯(lián)免疫法在檢測黃曲霉素的應(yīng)用中還表現(xiàn)出重復(fù)率低，且某些樣品還需要預(yù)處理，所以該方法一般用于初篩[24]。目前黃曲霉素的國家標準檢測方法主要包括膠體金法、薄層分析法、酶聯(lián)免疫法、高效液相色譜法、液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法等[25]，以酶聯(lián)免疫為基本原理的SNAP法在檢測黃曲霉毒素中的應(yīng)用還鮮有報道。

3 SNAP法的優(yōu)缺點及建議

3.1 SNAP法的優(yōu)點與不足

SNAP法在檢測抗生素殘留中有其優(yōu)點也有其不足，主要表現(xiàn)在檢測時間、廣譜性和檢測成本上。

從檢測的時間來看，SNAP法屬于快速檢測法，反應(yīng)時間不到10min[26]，反應(yīng)結(jié)果是當顏色越深或光度越強時表示陰性，反之表示陽性[27]。與國標TTC法、杯蝶法、薄層色譜法等相比，在檢測時間上具有明顯的優(yōu)勢。

從廣譜性來看，SNAP法只能保證對β-內(nèi)酰胺類抗生素具有較好的效果，能在低于MRL的濃度下就能檢測出β-內(nèi)酰胺類抗生素殘留，并且其穩(wěn)定性也較好；但是對除β內(nèi)酰胺類以外的抗生素并沒有表現(xiàn)出更好的檢測效果，甚至完全無效。同時，SNAP法只能進行定性檢測，無法檢測出準確的抗生素含量。SNAP法對黃曲霉素的檢測靈敏度同樣不高，易出現(xiàn)假陽性報告。

從檢測成本上來看，SNAP法檢測成本相對較高，需要購買專用儀器和試劑，但其儀器穩(wěn)定性良好，結(jié)果重現(xiàn)性好，并且儀器可隨身攜帶，便捷性遠高于其他方法。

3.2 建議

（1）在檢測β-內(nèi)酰胺類抗生素時，SNAP法具有極大的優(yōu)勢，在只需要定性檢測的情況下，完全可以替代其他方法。但若需要定量檢測時，SNAP法只可以作為篩選方法，然后對篩選出的陽性結(jié)果再進行定量檢測。但檢測結(jié)果也易出現(xiàn)假陽性，需用其他方法進行驗證。

（2）除此之外，該法對氨基糖苷類、大環(huán)內(nèi)酯類、四環(huán)素類和磺胺類等靈敏度較低，所以不建議單獨使用該法作為檢測該類抗生素的方法。同時該方法不能使用于對氟喹諾酮類抗生素和氯霉素的檢測。

（3）該法在檢測黃曲霉素時的靈敏度較低，在檢測黃曲霉素時，應(yīng)當與薄層色譜法相結(jié)合，將SNAP法作為初篩的方法，用薄層色譜法加以驗證。