謝文棟，旦久羅布，何世丞，次旦，嚴(yán)俊，張海鵬，高科

（西藏那曲市草原站，那曲 852000）

益生菌主要是指那些通過改善其宿主腸道微生態(tài)作用而有益于宿主的微生物活體。目前，市場上益生菌食品已有很多種，且市場占有率不斷上升，開發(fā)更多更新的益生菌產(chǎn)品是大勢(shì)所趨。干酪乳桿菌(Lactobacillus casei，Lc)和雙歧桿菌一樣，是益生菌中最具代表性的菌屬[1]。

經(jīng)研究表明干酪乳桿菌具有良好的耐酸性、人工胃腸液耐受性及膽鹽耐受性[2]，對(duì)免疫系統(tǒng)具有顯著的調(diào)節(jié)功能[3，4]，喂飼該菌體能顯著降低高脂飼料大鼠血清膽固醇和低密度脂蛋白含量[5]。這些研究證實(shí)該菌具有良好的益生潛力，因此對(duì)其發(fā)酵特性的研究具有重要的意義。本研究是在傳統(tǒng)牦牛乳酪(發(fā)酵劑為S.Lactis、Str.Cremoris)制作中添加不同量的干酪乳桿菌，觀測(cè)其發(fā)酵特性，為其進(jìn)一步開發(fā)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料

牦牛乳（來自西藏那曲地區(qū)）；3.7%的乳清蛋白濃縮物（WPC-34，新西蘭產(chǎn)），7.00%的白砂糖，0.35%的穩(wěn)定劑（明膠0.30%和果膠0.05%），均為質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2 菌種及添加量

菌種為乳酸鏈球菌（S.Lactis），乳脂鏈球菌（Str.Cremoris），Lc。將Lc制成母發(fā)酵劑后，按0、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%分別添加于原料乳中；S.Lactis和Str. Cremoris采用直投法，添加量為0.006%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))，編號(hào)見表1。

表1 菌種添加量

1.3 儀器設(shè)備

全乳成分分析儀(LacticheckTM LMA20132)，黏度計(jì)(BR OOKFIELD DV- E)，均質(zhì)機(jī)( 上海申鹿SR H60-70)，生化培養(yǎng)箱(上海一恒 LR H- 250)，離心機(jī)(上海安亭 GL- 20B)等。

1.4 方法

1.4.1 干酪乳桿菌的活化及發(fā)酵劑的制作

將-84℃冷凍保存的Lc接種于MRS液體培養(yǎng)基中，置37℃培養(yǎng)18h，傳代培養(yǎng)2次。

取上述Lc培養(yǎng)液5mL，經(jīng)3 500g離心10min，收集菌體，加入5mL滅菌生理鹽水洗滌2次后，混勻制成供試菌懸液，以2%接種于滅菌脫脂乳(質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11%，添加5%蔗糖和0.75%葡萄糖)中，置37℃培養(yǎng)12h，制成母發(fā)酵劑。

1.4.2 牦牛奶酪的生產(chǎn)工藝

1.5 發(fā)酵特性指標(biāo)測(cè)定

按上述工藝流程，當(dāng)原料乳冷卻至30℃時(shí)，將Lc、S.Lactis和Str. Cremoris按比例接種于其中，于30℃發(fā)酵。分別在0、3、6、9、12h和后熟12h(以H12h表示) 取樣測(cè)定其pH值、滴定酸度、黏度、持水性、菌落總數(shù)、蛋白水解能力等指標(biāo)( 平行實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值) 。 并將12h培養(yǎng)后的發(fā)酵乳樣放入4℃冰箱中冷藏保存，于7、14、21和28d分別取樣測(cè)定上述指標(biāo)。

1.5.1 pH值：采用精密pH計(jì)( 雷磁PHS- 3C) 測(cè)量。

1.5.2 滴定酸度：取發(fā)酵乳樣10mL，加入等體積的蒸餾水，混勻后，加入2滴酚酞作指示劑，用標(biāo)準(zhǔn)濃度為0.1mol/L的NaOH滴定。

1.5.3 活菌數(shù)：發(fā)酵乳樣用滅菌生理鹽水梯度稀釋至一定倍數(shù)后，采用Rogasa[6]選擇培養(yǎng)基平板傾注法，37℃培養(yǎng)48h后計(jì)菌落總數(shù)，測(cè)定Lc的活菌數(shù)。

1.5.4 黏度：采用Brookfield DV-1 VISCOMETER 黏度計(jì)進(jìn)行測(cè)定。

1.5.5 蛋白水解能力：樣品處理采用Abu-tarboush等方法[7]；蛋白水解能力測(cè)定采用Frank等建立的鄰苯二甲醛(OPA)法[8]。

1.5.6 持水力：將35g奶酪樣品置于離心機(jī)中，以3 500g離心10min。其計(jì)算公式為：

2 結(jié)果與分析

2.1 不同添加量Lc的產(chǎn)酸能力

不同添加量Lc樣品在30℃發(fā)酵過程中及在4℃冷藏過程中pH值及滴定酸度變化如圖1～4所示。

圖1 發(fā)酵過程中pH值變化

圖2 冷藏過程中pH值變化

圖4 冷藏過程中滴定酸度變化

由圖1和圖3可以看出，30℃發(fā)酵過程中，添加Lc的奶酪樣品pH值均較對(duì)照組低，滴定酸度均較對(duì)照組高。發(fā)酵至6h樣品的pH值和滴定酸度達(dá)到顯著水平，Lc加量為3.00%的5號(hào)樣pH值降幅最大為1.02（P＜0.05），對(duì)照組降幅為0.80。說明隨添加量的增大，Lc的產(chǎn)酸速率加快。

由圖2和圖4可以看出，4℃冷藏過程中，試驗(yàn)組與對(duì)照組的pH值有所降低，滴定酸度有所上升，組間差異不明顯(P＜0.05)。其中3.00%的5號(hào)樣pH值的降幅最大且僅為0.16，說明Lc在貯藏期間幾乎沒有后酸化現(xiàn)象。

2.2 活菌數(shù)變化

不同添加量Lc在30℃發(fā)酵過程中和4℃冷藏過程中的活菌數(shù)變化如圖5和圖6所示。

圖5 發(fā)酵過程中Lc菌數(shù)變化

圖6 冷藏過程中Lc菌數(shù)變化

由圖5可以看出，在30℃發(fā)酵過程中，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長，不同添加量Lc的生長度逐漸上升，3～6h為對(duì)數(shù)生長期，之后進(jìn)入平穩(wěn)期，一直持續(xù)到發(fā)酵結(jié)束。Lc添加量為3.00%的5號(hào)樣，在發(fā)酵6h時(shí)的活菌數(shù)為6.03×107/g；12h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，活菌數(shù)為1.58×108/g。

2.3 樣品黏度變化

不同添加量Lc在30℃發(fā)酵過程中和4℃冷藏過程中的黏度變化如圖7和圖8所示。

圖7 發(fā)酵過程中黏度變化

圖8 冷藏過程中黏度變化

由圖7可以看出，在30℃發(fā)酵過程中，3h后黏度開始上升；發(fā)酵至6h時(shí)，由于pH值的進(jìn)一步降低，黏度迅速增加，添加Lc的各組樣品的黏度均較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。

由圖8可以看出，在4℃冷藏中，對(duì)照組在冷藏28d中黏度幾乎不變化；其余各組樣品的黏度在冷藏7～14d中顯著降低，之后到28d黏度變化不明顯。

2.4 蛋白水解能力變化

不同添加量Lc在30℃發(fā)酵過程中和4℃冷藏過程中的蛋白水解能力變化如圖9和圖10所示。

圖9 發(fā)酵過程中可溶性蛋白氮變化

圖10 冷藏過程中可溶性蛋白氮變化

由圖9可以看出，各組樣品在30℃發(fā)酵過程中，隨發(fā)酵時(shí)間的延長可溶性氮的濃度略有增加。

由圖10可以看出，在4℃冷藏過程中，Lc添加量為1.00%的1號(hào)樣的可溶性氮先減少后增加，其余各組和對(duì)照組的可溶性氮均升高，尤其是在7～14d冷藏過程中可溶性氮升高的幅度較大。28d冷藏過程中添加Lc的各組樣品的可溶性氮略高于對(duì)照組，組間差異不顯著（P＞0.05）。

2.5 樣品持水力變化

圖11為不同添加量Lc奶酪樣品持水力變化。

圖11 樣品持水力變化

持水力是反映奶酪穩(wěn)定性的一個(gè)重要指標(biāo)，持水力好，奶酪的穩(wěn)定性就好。由圖11可以看出，發(fā)酵結(jié)束時(shí)，對(duì)照組的持水力最好。后熟12h后，對(duì)照組的持水力下降，而添加Lc的各組樣品的持水力明顯上升。4℃冷藏條件下，隨貯存天數(shù)的延長，各組樣品持水力有所下降。但在28d的冷藏過程中添加Lc的各組樣品的持水力好于對(duì)照組（P＜0.05）。

3 結(jié)論

本研究是在傳統(tǒng)奶酪(發(fā)酵劑為S.Lactis、Str.Cremoris) 基礎(chǔ)上，通過在原料奶中添加乳清蛋白濃縮物(WPC) 和適量穩(wěn)定劑，使總固形物濃度提高，再添加益生菌干酪乳桿菌（Lc），經(jīng)低溫(30℃)長時(shí)間(12h)發(fā)酵制成酸性乳酪( 蛋白4.5%)，省去了傳統(tǒng)工藝中的排乳清工序，最大限度地保留了奶酪中的營養(yǎng)成分。尤其是添加Lc后，產(chǎn)品的附加值更高。

試驗(yàn)過程中主要是對(duì)不同Lc添加量(0～3%)的發(fā)酵特性進(jìn)行了觀測(cè)，結(jié)果如下∶

(1)產(chǎn)酸能力。30℃發(fā)酵過程中，發(fā)酵至6h各組樣品的pH值顯著下降而滴定酸度顯著升高。其中從6h到12h發(fā)酵結(jié)束，各組樣品pH值和滴定酸度變化緩慢。4℃冷藏過程中各樣品的pH值及滴定酸度幾乎沒有變化，Lc不會(huì)造成奶酪在冷藏過程中的后酸化。

(2)活菌數(shù)。30℃發(fā)酵過程中，3～6h為Lc的對(duì)數(shù)生長期。Lc添加量為3.00%的樣品，在發(fā)酵6h時(shí)的活菌數(shù)為6.03×107/g；12h發(fā)酵結(jié)束時(shí)，活菌數(shù)為1.58×108/g。在4℃冷藏期間，Lc活菌數(shù)逐漸上升，添加3.00%Lc的樣品活菌數(shù)為9.77×108/g。

(3)黏度。30℃發(fā)酵過程中，3～6h各組樣品黏度顯著升高。發(fā)酵至6h時(shí)，添加Lc的各組樣品的黏度均較對(duì)照組顯著增加（P＜0.05）。4℃后熟12h后，添加Lc的各組樣品的黏度均較對(duì)照組增大（P＜0.05）。在4℃冷藏期間，對(duì)照組在冷藏28d中黏度幾乎不變化；其余各組樣品的黏度在冷藏7～14d中顯著降低，之后到28d黏度變化不明顯。

(4)蛋白水解能力。30℃發(fā)酵及4℃冷藏過程中，對(duì)照組與添加Lc組的可溶性氮濃度差異不顯著（P＜0.05），Lc的蛋白水解能力較弱。

(5)持水力。奶酪后熟12h后，添加Lc的各組樣品持水力明顯好于對(duì)照組。4℃冷藏條件下，隨貯存天數(shù)的延長，各組樣品持水力有所下降。 但在28d的冷藏過程中，添加Lc的各組樣品持水力好于對(duì)照組。

由以上試驗(yàn)所得結(jié)果可知，在奶酪發(fā)酵過程中，Lc不影響其他兩株菌 (S. Lactis、Str. Cremoris)的正常生長；在奶酪冷藏過程中，Lc一直在生長，這為Lc的產(chǎn)品開發(fā)提供了依據(jù)。