葛影影，張震，何國(guó)戈，鄭經(jīng)成，胡克科

（1.廣東省清遠(yuǎn)市農(nóng)業(yè)科技推廣服務(wù)中心，清遠(yuǎn) 511500；2.河南省奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定中心，鄭州 450000 ）

乳房炎是奶牛的一種常見(jiàn)、高發(fā)、難防、高淘汰的疾病，全世界每年因乳房炎造成的損失高達(dá)350多億美元[1]，我國(guó)每年因奶牛隱性乳房炎造成的損失約1.35億元，平均每個(gè)病例損失1 200～3 600元[2]。據(jù)報(bào)道，引發(fā)奶牛乳房炎的主要致病菌有細(xì)菌、病毒、支原體和真菌等，約150多種[3]，但以細(xì)菌性感染為主。奶牛乳房炎的發(fā)生除病原菌感染因素外，與季節(jié)、氣候的變化、環(huán)境衛(wèi)生狀況、飼養(yǎng)管理水平、擠奶設(shè)備消毒與監(jiān)測(cè)、奶牛自身及遺傳等因素也密切相關(guān)。調(diào)查發(fā)現(xiàn)，近年來(lái)河南省奶牛乳房炎的發(fā)病率偏高(70.66%)，其中臨床型乳房炎的平均發(fā)病率約7.18%，隱性乳房炎的平均發(fā)病率約63.48%[4]。獸醫(yī)臨床上用抗生素治療病原菌性奶牛乳房炎雖取得一定效果，但因地區(qū)差異，引起乳房炎的病原菌種類不同，長(zhǎng)期大量使用單一抗生素導(dǎo)致的病原菌產(chǎn)生耐藥性、乳汁獸藥和毒素殘留等問(wèn)題突出，增加了乳房炎治療工作的難度[5]。本研究針對(duì)河南地區(qū)奶牛乳房炎主要致病菌進(jìn)行了分離鑒定和臨床藥敏試驗(yàn)，旨在為減少該地區(qū)乳房炎發(fā)病率，降低牧場(chǎng)養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)損失，更好地保證乳品質(zhì)量安全提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 采樣對(duì)象

選擇河南4個(gè)地區(qū)20家奶牛場(chǎng)，采集乳樣共210份。

1.2 主要試劑

MH肉湯、營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，購(gòu)自青島日水生物技術(shù)股有限公司；伊紅美藍(lán)瓊脂培養(yǎng)基、卻普曼瓊脂培養(yǎng)基、革蘭氏染液，購(gòu)自青島高科園海博生物科技有限公司；藥敏紙片，購(gòu)自杭州微生物試劑有限公司；乳房炎病原菌基因組 DNA 提取試劑盒和奶牛乳房炎病原體檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自北京博奧生物集團(tuán)有限公司；加州隱性乳房炎診斷液，北京奶牛中心生產(chǎn)。

2 方法

2.1 乳樣采集

采樣前先用40℃左右的溫水清洗乳房，再用75%酒精棉球消毒，然后用一次性紙巾或消毒干毛巾將乳頭擦拭干凈，棄前三把奶后采集約20mL的奶樣，放入無(wú)防腐劑的無(wú)菌奶樣管，做好標(biāo)記。

2.2 乳房炎的檢測(cè)

2.2.1 加州乳房炎檢測(cè)法（CMT）

每個(gè)檢測(cè)盤內(nèi)加入2mL乳房炎檢測(cè)（CMT）試劑和2mL乳樣，傾斜45°緩慢晃動(dòng)，使盤內(nèi)的乳汁與檢測(cè)液充分混合。根據(jù)混合后乳汁狀態(tài)，結(jié)合試劑瓶上的說(shuō)明書進(jìn)行判定。CMT的判定標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表1。2.2.2 奶牛生產(chǎn)性能測(cè)定（DHI）

表1 CMT法的判定標(biāo)準(zhǔn)

將奶樣送至實(shí)驗(yàn)室，使用荷蘭Delta體細(xì)胞乳成分綜合分析儀測(cè)定體細(xì)胞和乳成分。通過(guò)檢測(cè)乳汁體細(xì)胞水平，并參考乳房炎SCC判定標(biāo)準(zhǔn)（≥50萬(wàn)個(gè)/mL），輔助診斷奶牛是否感染乳房炎及乳房炎的發(fā)病程度。根據(jù)乳成分測(cè)定結(jié)果，輔助分析奶牛日糧營(yíng)養(yǎng)水平是否合理。

2.3 主要病原菌的分離

對(duì)CMT檢測(cè)呈陽(yáng)性的乳樣進(jìn)行病原菌的分離鑒定，乳樣混勻后劃線接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)18～24h，挑取單菌落進(jìn)行涂片、染色和鏡檢。根據(jù)菌落生長(zhǎng)特征接種于麥康凱培養(yǎng)基、伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基、改良愛(ài)德華培養(yǎng)基等選擇性培養(yǎng)基， 進(jìn)一步純化培養(yǎng)后超低溫保存菌種。

2.4 恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析法

2.4.1 奶牛乳房炎基因組 DNA 提取

無(wú)菌條件下吸取1mL牛奶到無(wú)菌離心管(正常和隱性乳房炎牛奶取1mL；臨床癥狀明顯的牛奶最多取200μL)，12 000r/min離心5min，棄上清液，加入1mL生理鹽水和 TE 溶液充分混勻，12 000r/min 離心2min，棄上清留沉淀，然后按照乳房炎基因組DNA提取試劑盒使用說(shuō)明進(jìn)行操作。

2.4.2 DNA 質(zhì)量檢測(cè)

取5μL乳房炎核酸樣品置于微型分光光度計(jì)定量?jī)x器中測(cè)定。若定量結(jié)果≥25ng/μL，則稀釋到20ng/μL后與反應(yīng)液混合后上芯片檢測(cè)；若定量結(jié)果≤25ng/μ L，則直接與反應(yīng)液混合后上芯片檢測(cè)。

2.4.3 恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析檢測(cè)

根據(jù)芯片分析檢測(cè)說(shuō)明制備核酸分析檢測(cè)擴(kuò)增反應(yīng)體系，放入恒溫?cái)U(kuò)增微流控芯片核酸分析儀進(jìn)行核酸擴(kuò)增分析檢測(cè)。

2.5 藥敏試驗(yàn)

將分離純化的奶牛乳房炎主要致病菌接種于營(yíng)養(yǎng)MH肉湯，恒溫汽浴培養(yǎng)18h，用無(wú)菌生理鹽水將菌液稀釋至濃度約為2×106cfu/mL，吸取菌液200μL，用無(wú)菌涂布棒均勻涂布于MH瓊脂平板上。將12種藥敏紙片分別輕貼于兩個(gè)平板上，37℃恒溫培養(yǎng)18～24h，根據(jù)抑菌圈的直徑大小判定分離株對(duì)藥物的敏感性。藥敏試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)：抑菌環(huán)直徑≥20mm為高度敏感；10mm≤抑菌環(huán)直徑＜20mm為中度敏感；抑菌環(huán)直徑＜10mm為耐藥。

3 結(jié)果與分析

3.1 奶牛乳房炎發(fā)病率檢測(cè)結(jié)果

檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，奶牛乳房炎的總發(fā)病率為49.52%（104/210），其中臨床型乳房炎和隱性乳房炎的發(fā)病率分別為4.76%（10/210）、44.76%（94/210），兩者間發(fā)病率的比例接近5∶47。

3.2 乳房炎病原菌種類及比例

表2 乳房炎病原檢出種類及比例

從210份乳樣中共分離出287株乳房炎致病菌。其中，乳房鏈球菌、牛棒狀桿菌、無(wú)乳鏈球菌、大腸桿菌、牛支原體分別檢出118株、75株、34株、16株、17株，各占檢出比例的41.11%、26.13%、11.85%、5.57%、5.92%（表2）。

3.3 主要致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選取臨床上常用的11種抗菌藥物對(duì)奶牛乳房炎4種主要致病菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。結(jié)果顯示，乳房鏈球菌、無(wú)乳鏈球菌、牛棒狀桿菌、大腸桿菌對(duì)環(huán)丙沙星、恩諾沙星（喹諾酮類）高度敏感，對(duì)四環(huán)素、氯霉素中度敏感；對(duì)復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、頭孢喹啉中高度敏感；對(duì)青霉素耐藥（表3）。

表3 主要致病菌藥敏試驗(yàn)結(jié)果

4 討論

本試驗(yàn)通過(guò)恒溫?cái)U(kuò)增芯片法檢測(cè)210份陽(yáng)性乳樣，共檢出11種287株病原菌，球菌、桿菌以及支原體均被檢出，可見(jiàn)，細(xì)菌感染性乳房炎為常見(jiàn)多發(fā)。其中，鏈球菌、牛棒狀桿菌、大腸桿菌、牛支原體所占比率高達(dá)90.58% 。以上被檢出病原菌是引起河南地區(qū)奶牛乳房炎的主要致病菌。這與周婷婷等[6]的報(bào)道不完全一致。金黃色葡萄球菌檢出率明顯下降，可能是由于牧場(chǎng)對(duì)奶牛乳房和體軀的清洗、刷拭次數(shù)增加使皮膚保持干凈完整，擠奶工做好清潔操作和定期消毒工作，金黃色葡萄球菌不易通過(guò)損傷的皮膚侵染、定植。桿菌感染性乳房炎的發(fā)病率也較高，這與王建忠的報(bào)道基本一致[7]。大腸桿菌、牛棒狀桿菌、乳房鏈球菌均屬于環(huán)境性病原菌，主要是因畜舍內(nèi)外及奶廳的環(huán)境衛(wèi)生不良引起，如糞便污水、墊料土壤、污染的奶杯內(nèi)襯、骯臟的乳房乳頭表面均是環(huán)境性病原菌的生活場(chǎng)所。因此，乳房炎防控工作中應(yīng)加強(qiáng)擠奶設(shè)備的消毒和監(jiān)測(cè)、規(guī)范擠奶員工的標(biāo)準(zhǔn)化操作程序、及時(shí)清理糞污、定期更換墊料和消毒圈舍，以有效阻斷傳播途徑。其中，牛棒狀桿菌主要感染成年母牛，寄居在泌乳、干奶和妊娠階段奶牛乳腺內(nèi)的時(shí)間較長(zhǎng)，嚴(yán)重危害奶牛的產(chǎn)奶性能和乳品質(zhì)。目前，關(guān)于牛棒狀桿菌引發(fā)奶牛乳房炎的報(bào)道相對(duì)較少，其臨床診斷和防治尚需進(jìn)一步探究。本試驗(yàn)檢出了牛支原體性乳房炎。奶牛的擠奶、呼吸、輸精和分娩過(guò)程是傳播支原體的重要途徑[8]，感染支原體的奶牛乳區(qū)表現(xiàn)紅腫、脹痛，產(chǎn)奶量顯著下降，乳汁呈黃褐色膿汁狀，甚至停止產(chǎn)乳；有時(shí)會(huì)伴隨關(guān)節(jié)腫痛、肢蹄跛行、呼吸異常等癥狀，在奶牛生產(chǎn)中應(yīng)予以高度重視。

奶牛乳房炎的治療主要以抗生素為主。通過(guò)試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，河南地區(qū)治療奶牛乳房炎選擇的有效藥物有環(huán)丙沙星、恩諾沙星、復(fù)方新諾明、頭孢噻肟、頭孢喹啉等，原因是環(huán)丙沙星等作為喹諾酮類藥物的新一代產(chǎn)品，抗菌廣泛性好，抑制多種病原菌作用明顯[9]，這與韓瑞霞的研究報(bào)道相近[10]?？梢?jiàn)，喹諾酮類和頭孢菌素類抗菌藥物對(duì)河南地區(qū)幾種主要致病菌引起的奶牛乳房炎具有良好抑制作用。但以上四種主要致病菌對(duì)青霉素均產(chǎn)生耐藥性，可能是生產(chǎn)中長(zhǎng)期大量選擇使用價(jià)格低的青霉素導(dǎo)致耐藥菌株大量出現(xiàn)，菌株體內(nèi)出現(xiàn)耐藥基因，增加了抗性。因此，奶牛生產(chǎn)中開(kāi)展及時(shí)、準(zhǔn)確、有效的乳房炎主要病原菌的診斷與藥敏試驗(yàn)及相關(guān)耐藥基因的篩查工作，制定合理的交替用藥綜合防控方案，對(duì)縮短乳房炎治療時(shí)間、降低治療成本、減少經(jīng)濟(jì)損失有著重要意義。