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(中國海洋大學食品科學與工程學院,山東青島 266003)

小漿果是一種多汁肉質(zhì)單果,漿果類果樹種類很多,多分布于我國北方地區(qū),尤其是東北地區(qū)[1],除了具有獨特的鮮食風味,還具有豐富的保健營養(yǎng)價值,具有抗氧化、抗癌、改善肝臟解毒等功效[2],是近些年來世界上發(fā)展最為迅速的“第三代”新興水果,受到市場的青睞與歡迎。其中藍莓(VacciniumSpp.)、樹莓(RubuscorchorifoliusL. f.)、花楸(SorbuspohuashanensisH.)、藍靛果忍冬(LoniceracaeruleaL.)、草莓(FragariaananassaDuch.)等小漿果富含水溶性色素如花青素,相比沙棘(HippophaerhamnoidesL.)、枸杞(LyciumbarbarumL.)的脂溶性色素更易被人體利用吸收,成為替代人工合成色素的潛力資源[3]。

我國藍莓栽培起始于20世紀80年代,期間藍莓產(chǎn)業(yè)發(fā)展突飛猛進,截止2017年底,我國藍莓種植面積達70余萬畝,預計未來3～5年內(nèi),藍莓的種植面積將達300萬畝,樹莓在國外栽培歷史悠久,但近年來中國的樹莓產(chǎn)量也逐年提高,尤其是華北與東北地區(qū)[4-5]。藍靛果和黑果腺肋花楸作為兩種新興的小漿果,由于較高的營養(yǎng)價值及保健功能,近年來也引起了人們的注意。樹莓含有大量鞣花酸、單寧、槲皮素、沒食子酸、花青素等,具有抗氧化、延緩衰老、消除疲勞和抗癌等作用[6-7]。藍莓除了含常規(guī)的糖、酸、礦物質(zhì)元素和維生素外,還富含花青素、蛋白質(zhì)、超氧化物歧化酶(SOD)、熊果苷等成分,具有保護視力、延緩衰老、有效降低膽固醇、防止動脈粥樣硬化、預防癌癥等功效[8-9]。藍靛果營養(yǎng)豐富,富含糖類、氨基酸、多酚、花青素等,具有抗病毒、抗癌、改善高血壓、抵御疲勞、抗氧化等功效[10]。黑果腺肋花楸含有多種維生素和礦物質(zhì),還富含黃酮、花青素和多酚等物質(zhì),對心腦血管疾病具有特殊療效,還具有抗炎、降血糖血脂、抗氧化等保健功能[11-12]。小漿果富含很多天然活性成分,有利于減少機體的損傷和疾病的發(fā)生,是活性氧清除的潛在來源,并逐漸成為小漿果研究的熱點[8]。

國內(nèi)小漿果大多以凍果形式出口海外市場,目前在小漿果的栽培和繁育技術上研究報道很多,針對小漿果的高值化研究還不足。本實驗選取了兩種目前市場上火熱的小漿果藍莓和樹莓以及兩種新興小漿果藍靛果和黑果腺肋花楸作為研究對象,通過酶法制備成漿汁,對其多酚、SOD、花色苷及總黃酮含量進行考察,以維生素C做陽性對照,采用不同的自由基清除體系及脂質(zhì)過氧化探討了其抗氧化活性,并對活性成分含量與抗氧化活性相關性分析,以期為功能性產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù),能使其廣泛應用于功能食品、醫(yī)療保健及化妝品行業(yè)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

藍靛果、樹莓、藍莓、黑果腺肋花楸漿果 均購自東北長白山,鮮果成熟采摘后冷凍保存;果膠酶(酶活力為60000 U/mL)和β-葡萄糖苷酶(酶活力為4000 U/mL) 寧夏夏盛實業(yè)集團有限公司;蘆丁 國藥集團化學制劑有限責任公司;Folin-Ciocalteu試劑、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)和鄰苯三酚 Sigma公司;抗壞血酸、水楊酸、無水乙醇、甲醇、FeSO4、Tris堿、沒食子酸、CH3COONa、EDTA·2Na等 均為國產(chǎn)分析純。

L5S紫外可見分光光度計 上海儀電分析儀器有限公司;ESH105電子水分測定儀 上海舜宇恒平科學儀器有限公司;L530離心機 湖南湘儀實驗室儀器開發(fā)有限公司;HWS24型電熱恒溫水浴鍋 上海一恒科學儀器有限公司;THZ-82A水浴恒溫振蕩器 蘇州威爾實驗用品有限公司;BXS07-WYA-2S數(shù)字阿貝折射儀 北京北信科遠儀器有限責任公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品的處理 將冷凍保存的四種小漿果于常溫下自然解凍30 min后,按照實驗室之前優(yōu)化的最佳酶解工藝,向鮮果中加入質(zhì)量比1∶1的蒸餾水、質(zhì)量分數(shù)為0.02%的果膠酶和0.1%β-葡萄糖苷酶,在38 ℃下不斷攪拌復合酶解3 h完成后于4000 r/min離心20 min,得到上清即為小漿果漿汁樣品。

1.2.2 固形物含量的測定 根據(jù)NY/T 2637-2014[13]測定漿果中固形物含量來確定質(zhì)量濃度。取2～3滴漿果漿汁均勻分布于棱鏡表面,對準光源,記錄折射儀讀數(shù)。

1.2.3 多酚含量的測定 采用GB/T 31740.2-2015[14]對茶多酚含量檢測方法。分別取1 mL沒食子酸標準液、水(空白對照)及四種漿果漿汁與5 mL的Folin-Ciocalteu試劑充分混勻,靜置3～8 min后加入4 mL 7.5% Na2CO3水溶液混勻,60 min后,在765 nm下測定樣液吸光值。以沒食子酸作為標準品繪制標準曲線來定量小漿果中多酚,得到回歸方程y=0.0132x+0.039,R2=0.9996,其中y代表吸光度,x代表沒食子酸濃度(μg/mL),計算多酚含量。

式中,A為765 nm處的吸光值;SLOPEstd為沒食子酸標準曲線的斜率;d為稀釋因子。

1.2.5 花色苷含量的測定 根據(jù)花色苷特有性質(zhì),參照pH示差法[16]稍作修改來測定樣品中花色苷含量。四種小漿果漿汁分別用pH1.0的氯化鉀緩沖溶液(0.2 mol/L KCl∶0.2 mol/L HCl=25∶67)和pH4.5的醋酸鈉緩沖溶液(1 mol/L CH3COONa∶1 mol/L HCl∶H2O=100∶60∶90)稀釋10倍,對應空白組以溶劑代替樣品,在510 nm和700 nm處測吸光值。以矢車菊-3-葡萄糖苷表示總花色苷含量,計算公式如下:

A=(A510-A700)pH1.0-(A510-A700)pH4.5

式中,C為花色苷含量,mg/g;A510為510 nm處吸光值,A700為700 nm處吸光值;n為稀釋倍數(shù);449為矢車菊-3-葡萄糖苷的相對分子質(zhì)量;29600為矢車菊-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)。

1.2.6 總黃酮含量的測定 參照GB/T 20574-2006,采用NaNO2-Al(NO3)3比色法測定總黃酮含量[17]。以蘆丁為標樣,在堿性條件下于510 nm處測定顯色液的吸光度確定樣液中總黃酮的含量。分別吸取四種小漿果漿汁2 mL和30%乙醇溶液3 mL于試管中,加入5% NaNO2溶液0.3 mL搖勻,放置6 min后加入10% Al(NO3)3溶液0.3 mL搖勻,6 min后加入1 mol/L NaOH溶液4 mL,加水0.4 mL搖勻,于510 nm下測定吸光值,同時以2 mL樣液和8 mL乙醇溶液作為對照溶液,空白組將樣液替換成乙醇溶液。根據(jù)吸光值,利用蘆丁標準曲線來計算樣品中總黃酮的含量,得到回歸方程y=1.2028x-0.0111,R2=0.9998,其中y代表吸光度,x代表蘆丁濃度,mg/mL,計算總黃酮含量。

總黃酮含量(mg/mL)=Y×n

式中,Y為從回歸方程求得的蘆丁濃度,mg/mL;n為樣液稀釋倍數(shù);V為樣品體積,mL。

1.2.7 ·OH自由基的清除 參考Li等[18]的方法來測定樣品對羥自由基的清除效果。向試管中加入1 mL FeSO4(9 mmol/L)、1 mL水楊酸-乙醇(9 mmol/L)和1 mL不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,隨后加入1 mL H2O2(8 mmol/L)啟動反應,渦旋混勻后于37 ℃水浴鍋反應30 min,在510 nm下測定吸光值。對·OH自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai為樣品吸光值,Ai0為以蒸餾水代替H2O2測定的樣品本底吸收值,A0為以蒸餾水代替樣品溶液測定的空白對照吸光值。

式中,Ai為樣品吸光值,Ai0為測定的樣品本底吸收值,A0為以蒸餾水代替樣品溶液測定的空白對照吸光值。

1.2.9 DPPH·自由基的清除 根據(jù)Carmona-Jimenez等[21]和Marecek等[22]的方法測定樣品對DPPH·自由基清除活性。向試管中加入2 mL DPPH溶液(2 mmol/L,甲醇配制)和2 mL不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,渦旋混勻,于室溫黑暗條件下反應30 min,于517 nm下測定吸光值。對DPPH·自由基的清除作用公式如下:

式中,Ai為2 mL DPPH溶液+2 mL樣品溶液的吸光值,Ai0為2 mL樣品溶液+2 mL甲醇的本底吸光值,A0為2 mL DPPH溶液+2 mL甲醇的吸光值。

1.2.10 抗卵黃脂蛋白過氧化 按照趙麗[23]的方法,采用Fe2+誘發(fā)脂質(zhì)體的氧化來驗證抗脂質(zhì)過氧化功能。向試管中加入0.1 mL稀釋至25倍的卵黃懸液(用pH7.45,0.1 mol/L 的PBS配制),加入不同濃度的四種小漿果漿汁及VC溶液,加入0.1 mL FeSO4·7H2O溶液(25 mmol/L),隨后用PBS補足至2 mL。其對照組不加樣品溶液,其他同上。在37 ℃下水浴振蕩15 min。然后加入0.5 mL 20%的三氯乙酸,靜置10 min,在3500 r/min下離心10 min,取2 mL上清液加入1 mL 0.8%的硫代巴比妥酸,在100 ℃下沸水浴15 min,冷卻后在532 nm下測定吸光值,用PBS調(diào)零。對脂質(zhì)過氧化的抑制作用公式如下:

式中,A0為空白對照液的吸光值,Ai為加入樣品溶液后的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 22統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行處理,實驗結果以平均值±標準差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩組均數(shù)之間采用q檢驗,實驗重復3次,結果取平均值。相關性及顯著性分析采用SPSS 22統(tǒng)計軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 四種小漿果漿汁的固形物含量

藍靛果、樹莓、藍莓、黑果腺肋花楸四種小漿果按照相同的制備方式得到漿汁樣品,測得可溶性固形物含量依次為153.2、116.1、188.1和127.2 mg/mL,后續(xù)的活性實驗通過將其稀釋合適的倍數(shù)得到的固形物含量來作為參與反應的質(zhì)量濃度。

2.2 四種小漿果漿汁活性成分比較

四種小漿果漿汁的活性成分研究結果見表1。四種小漿果漿汁的活性成分含量差異顯著(p<0.05),同時,與樹莓、藍莓、黑果腺肋花楸相比,藍靛果的多酚、SOD活力、花色苷以及總黃酮含量都是最高的,有相關文獻報道花青素-3-葡萄糖苷是漿果品種中最突出的花青素,Chen等人[24]發(fā)現(xiàn)藍靛果中花青素-3-葡萄糖苷含量高于其他漿果,如藍莓,黑莓和覆盆子,Hwang等人[25]也發(fā)現(xiàn)藍靛果提取物總多酚含量顯著高于花楸果和藍莓提取物,這與本實驗結果是一致的,從表1的數(shù)據(jù)可以看出藍靛果的多酚、SOD酶和總黃酮是其他三種小漿果含量的1.5～7倍,花色苷(3.768 mg/mL)則是黑果腺肋花楸含量的14倍左右,說明藍靛果含有更豐富的天然活性成分,凸顯了其在醫(yī)療、保健食品、化妝品行業(yè)中潛在的應用價值。

表1 四種小漿果漿汁活性成分含量Table 1 Active components content of four kinds of small berry juices

2.3 四種小漿果漿汁體外抗氧化活性比較

2.3.1 ·OH自由基的清除能力 ·OH自由基被看作氧化代謝的有毒副產(chǎn)物,在生物體內(nèi)具有極高的反應活性,是活性氧中最活潑的自由基,能夠?qū)е录毎x、功能和結構的改變[26]。以VC為陽性對照,四種小漿果漿汁對·OH自由基的清除效果如圖1所示,由圖可知,各漿果漿汁及VC對·OH自由基的清除率隨質(zhì)量濃度增加而增大,四種小漿果漿汁的清除活性存在一定的差異,效果均低于VC,VC對·OH自由基的IC50值為0.213 mg/mL(50%清除率所需樣品濃度),藍靛果、黑果腺肋花楸、樹莓和藍莓IC50值分別為2.066、3.017、11.208和9.641 mg/mL。當加入的質(zhì)量濃度為4 mg/mL時,藍靛果和黑果腺肋花楸對·OH自由基清除率可達到93.27%和70.45%,對·OH自由基清除效果具有明顯優(yōu)勢。

圖1 四種小漿果漿汁對·OH自由基的清除作用Fig.1 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on OH radical

圖2 四種小漿果漿汁對自由基的清除效果Fig.2 Scavenging effect of four kinds of small

2.3.3 DPPH·自由基的清除能力 由圖3可以看出,四種小漿果漿汁對DPPH·自由基的清除率隨質(zhì)量濃度的增加而增強,且具有明顯的量效關系,VC亦之。四種漿果漿汁之間清除活性存在一定差異,VC對DPPH·自由基的清除效果要優(yōu)于這四種小漿果漿汁,VC的IC50值為17.999 μg/mL,藍靛果、黑果腺肋花楸、樹莓和藍莓的IC50值分別為61.342、79.190、114.453和127.536 μg/mL。藍靛果和黑果腺肋花楸對DPPH·自由基具有良好的清除活性,當質(zhì)量濃度為150 μg/mL時,藍靛果和黑果腺肋花楸對DPPH·自由基的清除率可達到96.01%和86.94%。由于小漿果的漿汁仍只是粗提取,若做進一步純化處理,將會縮小與VC的差距。

圖3 四種小漿果漿汁對DPPH·自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of four kinds of small berry juices on DPPH radical

2.3.4 抗卵黃脂蛋白過氧化能力 脂質(zhì)過氧化會產(chǎn)生有細胞毒性的脂質(zhì)過氧化物,會破壞人體細胞正常生理功能,促使人體衰老和誘發(fā)癌癥。由圖4可知,以VC為陽性對照,四種小漿果漿汁對卵黃脂蛋白過氧化均有抑制效果,且隨著質(zhì)量濃度的增大抗氧化活性也在增強。四種小漿果抗脂質(zhì)過氧化活性存在差異,當質(zhì)量濃度為100 μg/mL時,藍靛果、黑果腺肋花楸、樹莓和藍莓對脂質(zhì)過氧化抑制率分別為42.78%、29.35%、10.44%和6.91%,而相同質(zhì)量濃度下VC對脂質(zhì)過氧化抑制率為9.44%。隨著質(zhì)量濃度的增大,VC的抗氧化效果明顯增強,而小漿果抑制氧化反而不夠明顯,可能是由于漿果漿汁本身的顏色干擾了吸光度的測定，從而影響了活性結果。藍靛果和黑果腺肋花楸具有較明顯的優(yōu)勢,其中VC的IC50值為160.856 μg/mL,藍靛果、黑果腺肋花楸、樹莓和藍莓的IC50值分別為181.590、196.732、321.342和394.421 μg/mL。

圖4 四種小漿果漿汁抗脂質(zhì)過氧化效果Fig.4 Anti-lipid peroxidation effect of four kinds of small berry juices

表2 活性成分含量與抗氧化活性的相關性Table 2 Correlation between active components content and antioxidant activities

3 結論

本實驗對小漿果漿汁的活性成分比較研究中發(fā)現(xiàn)四種東北特產(chǎn)小漿果漿汁活性成分含量差異顯著(p<0.05),相比之下藍靛果含有更高含量的天然活性成分,藍靛果的多酚、SOD酶和總黃酮含量是藍莓,樹莓及黑果腺肋花楸的1.5～7倍,而花色苷含量則高達黑果腺肋花楸的14倍左右,這也符合藍靛果具有高花青素含量的文獻報道。

相關性分析表明，抗氧化能力與活性成分含量呈正相關,除了SOD活力與·OH自由基清除率顯著相關(p<0.05)之外,其他均極顯著相關(p<0.01),相關系數(shù)表明，小漿果漿汁的這些活性成分可能為其抗氧化的基本物質(zhì)基礎。