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(1.貴州大學(xué)釀酒與食品工程學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025;2.貴州省藥食同源植物資源開(kāi)發(fā)工程技術(shù)研究中心,貴州貴陽(yáng) 550025;3.貴州大學(xué)中藥天然藥研發(fā)中心,貴州貴陽(yáng) 550025;4.西南藥食兩用資源開(kāi)發(fā)利用技術(shù)國(guó)家地方聯(lián)合工程研究中心,貴州貴陽(yáng) 550025;5.貴陽(yáng)中醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院,貴州貴陽(yáng) 550025)

薏苡仁(Coixlacryma-jobiL.var.mayuen(Roman.)Stapf)為一年或多年生禾本科植物薏苡的種仁,我國(guó)大部分地區(qū)都有生產(chǎn),貴州興仁為主產(chǎn)區(qū)之一,約占全國(guó)薏仁種植面積的80%。興仁薏仁米產(chǎn)于貴州省黔西南州,是國(guó)家質(zhì)檢總局地理標(biāo)志產(chǎn)品。薏苡仁除藥用外,還常常作為副食品用,故被用作藥食兩用資源[1]。薏苡渾身是寶,已被國(guó)內(nèi)外學(xué)者廣泛研究,其主要化學(xué)成分為油酯類、糖類、蛋白質(zhì)類、礦物質(zhì)及其他[2]。其藥理作用研究表明,薏苡仁具有抗腫瘤[3]、降血糖[4]、抗?jié)儭⒅篂a[5]、消炎鎮(zhèn)痛[6]、降血脂[7]等功效。

已有研究報(bào)道,Yang R S等[8]利用去卵巢抗骨質(zhì)疏松大鼠模型評(píng)估了薏苡仁水提物對(duì)骨質(zhì)疏松癥預(yù)防的影響,這一發(fā)現(xiàn)提示薏苡仁提取物有著能夠逆轉(zhuǎn)大鼠骨質(zhì)疏松狀態(tài)的功效,故而薏苡仁具有作為有效預(yù)防骨質(zhì)疏松癥的健康食品的潛力。有相關(guān)研究表明薏苡仁種子中含量最多的成分為薏苡仁油[9],故本實(shí)驗(yàn)將對(duì)黔產(chǎn)薏苡仁進(jìn)行薏苡仁油脂的提取并對(duì)其進(jìn)行脂肪酸的GC-MS分析,進(jìn)一步將不同濃度的黔產(chǎn)薏苡仁油(0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL)作用于1α,25-(OH)2VitD3誘導(dǎo)的原代分離的新西蘭乳兔骨髓細(xì)胞[10],以抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)+細(xì)胞數(shù)、TRAP酶活力及骨陷窩面積作為指標(biāo),來(lái)反映薏苡仁油對(duì)抑制破骨細(xì)胞分化及骨吸收活力的影響[11],為研究薏苡仁對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

黔產(chǎn)薏苡仁 來(lái)自中國(guó)薏仁米之鄉(xiāng)——興仁縣原產(chǎn)地;新西蘭乳兔(出生48 h以內(nèi)) 貴陽(yáng)經(jīng)濟(jì)技術(shù)開(kāi)發(fā)區(qū)鵬程農(nóng)業(yè)科技有限公司,合格證號(hào):SCXK(黔)2012-001;骨磨片 蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院骨科研究所;α-MEM培養(yǎng)基 美國(guó)Gibco公司;胎牛血清 浙江天杭生物科技股份有限公司;抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)測(cè)試盒 南京建成生物工程研究所;MTT(噻唑藍(lán))、DMSO(二甲基亞砜) 北京索萊寶生物科技有限公司;甲苯胺藍(lán)、1α,25-(OH)2VitD3、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色試劑盒 日本Sigma公司。

HP6890/5975C氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀 美國(guó)安捷倫公司;手動(dòng)固相微萃取裝置、萃取纖維(2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableF-lex) 美國(guó)Supelco公司;3110 水套系列CO2恒溫恒濕培養(yǎng)箱、Multiskan FC多功能酶標(biāo)儀 美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái) 蘇州凈化設(shè)備有限公司;DMi8-M倒置熒光顯微鏡 Leica Microsystemes CMS GmbH Ernst-Leitz-Str公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 黔產(chǎn)薏苡仁油的提取與制備 本研究采用的是無(wú)水乙醇超聲輔助法提取黔產(chǎn)薏苡仁油[12]:將成熟自然風(fēng)干的黔產(chǎn)薏苡仁種子粉碎至物料粒徑為60～80目后,稱取50 g黔產(chǎn)薏苡仁粉末,料液比為(薏苡仁粉末∶無(wú)水乙醇)1∶3.5 g/mL,溫度為50 ℃,超聲功率350 W,超聲頻率30 kHz,提取時(shí)間40 min,最后得到2.2 g的黔產(chǎn)薏苡仁油。稱取100 mg黔產(chǎn)薏苡仁油,用1 mL DMSO溶解,得濃度為1.0×105μg/mL母液,儲(chǔ)存于4 ℃冰箱中備用。

1.2.2 黔產(chǎn)薏苡仁油的脂肪酸殘基GC-MS分析 首先將黔產(chǎn)薏苡仁油甲脂化后,采用微量注射器注入樣品溶液進(jìn)行GC-MS分析,用標(biāo)準(zhǔn)脂肪酸甲脂作為參照來(lái)確定樣品中的脂肪酸成分。GC-MS分析條件:采用FB-5MSI(30 m×0.25 mm×0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱,柱溫為50～309 ℃(每分鐘升溫8 ℃);離子源溫度230 ℃;離子源為EI源;電子能量70 eV。對(duì)總離子流圖中的各峰均用質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)進(jìn)行分析和處理,同時(shí)通過(guò)核對(duì)Nist2005和Wiley275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖,確定了黔產(chǎn)薏苡仁油脂肪酸殘基中的14種揮發(fā)性化學(xué)成分,各化學(xué)成分均使用峰面積歸一化法測(cè)定其相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.2.3 骨髓細(xì)胞的分離與培養(yǎng) 將購(gòu)買來(lái)的出生48 h以內(nèi)的新西蘭乳兔,斷頸處死,用75%乙醇浸泡15 min以上,在超凈工作臺(tái)中取出乳兔后肢,浸泡于PBS中,用醫(yī)用紗布剝離出股骨,浸泡于含10%血清的α-MEM完全培養(yǎng)基中,用手術(shù)剪縱向剪開(kāi)乳兔股骨,用手術(shù)刀輕輕刮下骨髓內(nèi)細(xì)胞,吹打混勻后渦旋30 s,用200目細(xì)胞篩過(guò)篩,獲得乳兔原代骨髓細(xì)胞。根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求,96孔培養(yǎng)板:將原代骨髓細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至5×105個(gè)/mL后接種,48孔培養(yǎng)板:將原代骨髓細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度至2×106個(gè)/mL后接種。于5% CO2、37 ℃、飽和濕度條件下培養(yǎng)穩(wěn)定24 h后,用適量PBS輕輕洗一遍。

1.2.4 對(duì)骨髓細(xì)胞存活率的影響 用含10%血清的α-MEM完全培養(yǎng)基,采用倍半稀釋法,將黔產(chǎn)薏苡仁油調(diào)整為不同濃度(0.06～1000 μg/mL)培養(yǎng)液后加入到接有原代骨髓細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中,實(shí)驗(yàn)設(shè)置空白組(空白培養(yǎng)液為不含薏苡仁油,含10%血清的α-MEM完全培養(yǎng)基)。之后每2 d更換一次培養(yǎng)液,藥物作用6 d后,換入含10%的5 mg/mL MTT的α-MEM完全培養(yǎng)基,置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中孵育4 h,用注射器小心吸棄上清液,每孔加入適量DMSO,振蕩10 min,使用多功能酶標(biāo)儀在波長(zhǎng)490 nm處檢測(cè)OD值。

1.2.5 實(shí)驗(yàn)分組 分別設(shè)置實(shí)驗(yàn)組:含不同濃度黔產(chǎn)薏苡仁油(A:31.25 μg/mL,B:15.63 μg/mL,C:7.81 μg/mL,D:3.91 μg/mL,E:1.95 μg/mL,F:0.98 μg/mL)的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養(yǎng)基;陽(yáng)性對(duì)照組G:含10-8mol/L雌二醇的10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養(yǎng)基;陰性對(duì)照組H:含10%血清及10-8mol/L 1α,25-(OH)2VitD3的α-MEM完全培養(yǎng)基。

1.2.6 TRAP染色 將不同的實(shí)驗(yàn)分組加入到接有原代骨髓細(xì)胞的48孔培養(yǎng)板中,每隔2 d換一次培養(yǎng)液,藥物連續(xù)作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,用固定液(25%檸檬酸緩沖鹽,10%甲醛,65%丙酮)固定5 min,雙蒸水輕輕洗一遍,將水吸干,加入染液,37 ℃避光孵育1 h,顯微鏡下觀察,拍照,用雙蒸水輕輕洗一遍,用蘇木素復(fù)染5 min,流式?jīng)_洗返藍(lán),顯微鏡下對(duì)TRAP陽(yáng)性細(xì)胞(細(xì)胞胞漿內(nèi)形成紫紅色沉淀、多核)計(jì)數(shù)、拍照。

1.2.7 TRAP酶活力測(cè)定 按照實(shí)驗(yàn)分組將不同濃度藥物加入到接有原代骨髓細(xì)胞的48孔培養(yǎng)板中,每隔2 d換一次培養(yǎng)液,藥物作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,每孔加入適量裂解液(0.2% Tritanx-100),置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱裂解5～10 min,取細(xì)胞裂解液按抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.8 骨吸收陷窩面積測(cè)定 按照實(shí)驗(yàn)分組將不同濃度藥物加入到接有原代骨髓細(xì)胞(提前放有6 mm×6 mm大小骨磨片)的48孔培養(yǎng)板中,每隔2 d換一次培養(yǎng)液,藥物作用8 d后,吸去上清液,用PBS輕輕洗一遍,用10%甲醛溶液固定5 min,用雙蒸水輕輕洗一遍,加入0.25 mol/L的氨水超聲5 min,依次采用適量80%、85%、95%無(wú)水乙醇梯度洗脫,每次2 min,用0.1%甲苯胺藍(lán)溶液染色5 min,最后使用熒光倒置顯微鏡拍照并計(jì)算面積。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均使用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 黔產(chǎn)薏苡仁油的脂肪酸殘基GC-MS分析

結(jié)合GC及GC-MS技術(shù)(圖1)確定薏苡仁油的脂肪酸殘基分別為十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亞油酸)、二十二烷酸(山崳酸)、角鯊烯和γ-谷甾醇(見(jiàn)表1、表2),都為碳數(shù)12以上的脂肪酸。

圖1 黔產(chǎn)薏苡仁油的總離子流圖Fig.1 Total ion current diagram of Coix seed oil in Guizhou

表1 黔產(chǎn)薏苡仁油的脂肪酸殘基特征碎片離子解析表Table 1 Fatty acid residue characteristic fragment ion analysis table of coix seed oil in Guizhou

表2 黔產(chǎn)薏苡仁油中的脂肪酸殘基有效成分定性分析Table 2 Qualitative analysis of effective components of fatty acid residues in coix seed oil in Guizhou

2.2 對(duì)骨髓細(xì)胞存活率的影響

原代骨髓細(xì)胞培養(yǎng)7 d后,顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),細(xì)胞能均勻鋪滿96孔培養(yǎng)板底部,將不同濃度黔產(chǎn)薏苡仁油(0.06～1000 μg/mL)培養(yǎng)液作用于兔原代骨髓細(xì)胞6 d后,與空白組相比,細(xì)胞存活率隨濃度的升高而不斷降低,當(dāng)濃度高于31.25 μg/mL時(shí),細(xì)胞存活率低于100%(見(jiàn)圖2)。當(dāng)細(xì)胞存活率趨于穩(wěn)定時(shí)(在100%附近)可認(rèn)為該藥物濃度對(duì)該細(xì)胞毒性較小,從而排除藥物毒性對(duì)實(shí)驗(yàn)的干擾,故選擇0.98、1.95、3.91、7.81、15.63、31.25 μg/mL作為實(shí)驗(yàn)濃度最為適宜。

圖2 黔產(chǎn)薏苡仁油對(duì)骨髓細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of coix seed oil in Guizhou on survival rate of bone marrow cells

2.3 TRAP染色

通過(guò)比較TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目及大小,可以衡量破骨細(xì)胞活性大小(表3，圖3)。各濃度組與陰性對(duì)照組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)相比,均具有顯著性(p<0.05),陰性對(duì)照組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目較多,且體積大、核較多,陽(yáng)性對(duì)照組和黔產(chǎn)薏苡仁組TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目均相對(duì)較少,且體積小、核少;黔產(chǎn)薏苡仁油不同濃度組的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)隨樣品作用濃度升高而逐漸減少,其中高濃度A組31.25 μg/mL的TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)最少,且細(xì)胞較小,存在明顯的濃度依賴性。

圖3 TRAP陽(yáng)性細(xì)胞染色Fig.3 TRAP positive cells staining注:A:黔產(chǎn)薏苡仁油31.25 μg/mL組;B:黔產(chǎn)薏苡仁油15.63 μg/mL組;C:黔產(chǎn)薏苡仁油7.81 μg/mL組;D:黔產(chǎn)薏苡仁油3.91 μg/mL組;E:黔產(chǎn)薏苡仁油1.95 μg/mL組;F:黔產(chǎn)薏苡仁油0.98 μg/mL組;G陰性組;H陽(yáng)性組。表3、圖4、圖5同。

表3 TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及TRAP酶活力的影響Table 3 Effects of TRAP positive cell number

2.4 TRAP酶活力測(cè)定

抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨細(xì)胞里面是一種特殊的標(biāo)志性磷酸酶,所以可以用TRAP酶活來(lái)衡量破骨細(xì)胞活性。由表3可知,與陰性對(duì)照組相比,各濃度組均具有顯著性差異(p<0.05),陰性組TRAP酶活力較大,各不同濃度給藥組的TRAP酶活力隨作用濃度的升高而逐漸下降,其中高濃度A組31.25 μg/mL的酶活力明顯較低,且存在明顯的濃度依賴性,與TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)結(jié)果相一致。

2.5 骨陷窩面積

骨吸收陷窩則是破骨細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)部進(jìn)行骨吸收過(guò)程的直接結(jié)果,因此可以用這一指標(biāo)來(lái)反映破骨細(xì)胞的活性。由圖4、圖5可知,與陰性對(duì)照組相比,各濃度組均具有顯著性差異(p<0.05),陰性組骨陷窩面積較大,各不同濃度給藥組骨陷窩面積隨作用濃度的升高而逐漸減少,其中高濃度A組31.25 μg/mL的骨陷窩面積明顯較低,且存在明顯的濃度依賴性,與TRAP陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)及TRAP酶活結(jié)果相一致。

圖5 骨膜片染色Fig.5 Periosteum staining

圖4 骨陷窩面積結(jié)果Fig.4 Results of bone lacunae

3 討論與結(jié)論

在骨吸收、代謝的過(guò)程中,主要由成骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨形成,破骨細(xì)胞負(fù)責(zé)骨吸收,而在機(jī)體里面為了維持正常的骨量,骨吸收和骨形成一直處于一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程,如果這一平衡被打破將會(huì)產(chǎn)生諸多骨病,如骨質(zhì)疏松、骨硬化等,因此研究藥物對(duì)破骨細(xì)胞的活性影響可以推測(cè)出該藥物是否對(duì)骨質(zhì)疏松癥具有一定的預(yù)防和治療作用[13]。而抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)在破骨細(xì)胞里面是一種特殊的標(biāo)志性磷酸酶,所以通常把TRAP酶活作為衡量破骨細(xì)胞活性的一個(gè)重要標(biāo)志[14];骨吸收陷窩則是破骨細(xì)胞在機(jī)體內(nèi)部進(jìn)行骨吸收過(guò)程的直接結(jié)果,因此也可以用這一指標(biāo)來(lái)反映破骨細(xì)胞的活性。

本實(shí)驗(yàn)首先通過(guò)無(wú)水乙醇超聲輔助法對(duì)黔產(chǎn)薏苡仁油進(jìn)行提取,并對(duì)其成分進(jìn)行GC-MS分析,脂肪酸殘基GC-MS分析得出黔產(chǎn)薏苡仁油的脂肪酸殘基主要為十四烷酸(肉豆蔻酸)、十六烷酸(棕櫚酸)、十八烷酸(硬脂酸)、十八碳一烯酸(油酸)、十八碳二烯酸(亞油酸)、二十二烷酸(山崳酸)、角鯊烯和γ-谷甾醇;亞油酸是一種必需脂肪酸,在黔產(chǎn)薏苡仁油中的含量超過(guò)31.793%,具有增強(qiáng)機(jī)體免疫力、促進(jìn)骨組織代謝和抗腫瘤等作用[15];油酸則是黔產(chǎn)薏苡仁油中最主要的不飽和脂肪酸,具有良好的抗炎、抗氧化性[16];角鯊烯具有增強(qiáng)機(jī)體免疫能力、抗炎、抗氧化及抗腫瘤等生理活性[17];相關(guān)研究表明,破骨細(xì)胞的活化有兩條通路:主要通路是RANKL/RANK/NF-κB或JNK通路;次要通路是IL-1、TNF-α等炎癥因子激活的非RANKL/RANK依賴通路,兩者是相互聯(lián)系的,炎癥都參與激活破骨細(xì)胞分化的兩條通路,而破骨細(xì)胞又是骨吸收過(guò)程中的最終作用細(xì)胞,因此炎癥的產(chǎn)生可以通過(guò)增加破骨細(xì)胞的活性,來(lái)使其在骨吸收中發(fā)揮重要作用[18]。在進(jìn)一步的黔產(chǎn)薏苡仁油對(duì)破骨細(xì)胞活性影響實(shí)驗(yàn)中,TRAP染色、TRAP 酶活力分析和骨吸收陷窩面積的結(jié)果均表明,黔產(chǎn)薏苡仁油能顯著抑制破骨細(xì)胞的活性。在本實(shí)驗(yàn)的研究中,黔產(chǎn)薏苡仁油抑制破骨細(xì)胞活性的影響均呈現(xiàn)良好劑量依賴性,高濃度組對(duì)破骨細(xì)胞活性的抑制作用較強(qiáng),該抑制作用隨著藥物濃度的降低而不斷減弱,其中高濃度劑量A組31.25 μg/mL的抑制作用最為顯著(p<0.05)。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以推測(cè),黔產(chǎn)薏苡仁油對(duì)骨質(zhì)疏松具有一定的預(yù)防和治療作用,這種作用可能是通過(guò)抑制破骨細(xì)胞活性來(lái)實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)為進(jìn)一步研究薏苡仁對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防作用奠定了基礎(chǔ),而薏苡仁油在調(diào)節(jié)骨吸收和代謝平衡中的作用及其機(jī)制,還有待于更進(jìn)一步的研究。