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(1.廣東環(huán)凱微生物科技有限公司,廣東廣州 510663;2.廣東省微生物研究所,廣東廣州 510070)

副干酪乳桿菌(Lactobacillusparacasei)為益生菌中乳桿菌屬的干酪乳桿菌,有良好的耐酸及膽汁抗性,具有能調(diào)節(jié)腸道生態(tài)平衡、增強(qiáng)免疫力、抗腫瘤、降膽固醇、降血壓和預(yù)防糖尿病發(fā)生等生理功能[1],以其為原料開發(fā)功能食品具有明確的保健意義。但益生菌在生長(zhǎng)過程中,不形成芽孢,抗性較差,貯存穩(wěn)定性差,其保健功效損失快。為提高加工和儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性,確保最多的活菌數(shù)達(dá)到腸道才釋放,從而發(fā)揮益生菌的最大功能活性,將益生菌經(jīng)微膠囊技術(shù)包埋是有效的方法之一。

微膠囊化技術(shù)是采用天然或合成的高分子材料為囊材,通過化學(xué)、物理或物理化學(xué)法將活性物質(zhì)即囊芯包裹起來形成半透性或密封性囊膜的微型膠囊[2]。然而一些研究表明[3],微囊化對(duì)益生菌在胃液中的存活并沒有顯現(xiàn)出較好的保護(hù)效果。因此研究者們主要通過3種手段提高微囊對(duì)活菌的保護(hù)效果:第一種是通過在微囊表面進(jìn)行包衣[4];第二種是使用多種壁材復(fù)配[5-6];第三種是在壁材中加入益生元,提高益生菌對(duì)不利生長(zhǎng)環(huán)境的適應(yīng)性,從而提高其存活率[7]。制得的微膠囊主要有儲(chǔ)集型、基質(zhì)型和涂層基質(zhì)型三種類型。其中芯材被壁材膜完全包被的為儲(chǔ)集型微膠囊,芯材被分散在壁材內(nèi)部和表面的為基質(zhì)型微膠囊,涂層基質(zhì)型微膠囊則是前兩者的結(jié)合[8]。其中,雙層包埋制得的涂層基質(zhì)型微囊較多。

本試驗(yàn)中研究的乳酸菌R8,為本試驗(yàn)室經(jīng)過抗性篩選、馴化選育的優(yōu)良菌種,并鑒定為副干酪乳桿菌[9]。目前該菌種經(jīng)高密培養(yǎng)的發(fā)酵工藝研究、放大工藝優(yōu)化,可實(shí)現(xiàn)250 L規(guī)模的發(fā)酵生產(chǎn)[10]。為進(jìn)一步提高R8的穩(wěn)定性,并實(shí)現(xiàn)在腸道定向釋放的目的,本試驗(yàn)采用多種手段增強(qiáng)微囊對(duì)益生菌的保護(hù)作用,擬將蛋白質(zhì)和海藻酸鈉復(fù)配為首層包埋壁材,然后在固定液中用殼聚糖覆膜,制備雙層包埋的涂層基質(zhì)型微囊微膠囊,使在益生菌周圍形成致密的物理屏障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

副干酪乳桿菌R8 廣東省微生物研究所篩選馴化提供[9];MRS培養(yǎng)基(g/L):葡萄糖20.0 g,胰蛋白胨10.0 g,牛肉膏8.0 g,酵母粉4.0 g,Tween80 1.0 mL,K2HPO42.0 g,MgSO4·7H2O 0.2 g,MnSO4·4H2O 0.05 g,檸檬酸銨2.0 g,CH3COONa·3H2O 5.0 g,蒸餾水1000 mL,pH6.2;乳糖、海藻酸鈉、殼聚糖 食品級(jí),廣東大地食用化工有限公司;脫脂乳粉 食品級(jí),廣州碩維食品技術(shù)有限公司;豆粉 食品級(jí),深圳市圣菂科技有限公司;香蕉、雞蛋 市售;氯化鈣 食品級(jí),鄭州瑞普生物工程有限公司;低聚半乳糖(95S)、低聚果糖(90S) 量子高科(中國(guó))生物股份有限公司;菊粉 山東保齡寶生物技術(shù)有限公司。

Avanti J-20XP離心機(jī) 美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司;YC-015實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī) 上海雅程儀器設(shè)備有限公司;LGJ-1冷凍干燥機(jī) 上海醫(yī)用分析儀器廠;UV-1800全波長(zhǎng)掃描分光光度計(jì) 日本島津公司;HZQ-F100振蕩培養(yǎng)箱 哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 凍干保護(hù)劑種類的篩選 根據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn),所篩選的乳酸菌凍干保護(hù)劑有10%乳糖、10%脫脂乳粉、10%豆粉、20%香蕉、20%全蛋水溶液。

副干酪乳桿菌R8經(jīng)活化、發(fā)酵培養(yǎng)[11]后,經(jīng)離心(8000 r/min,4 ℃離心10 min)收集的菌泥(干重計(jì)活菌數(shù)1.83×1011cfu/g)分別加入上述凍干保護(hù)劑的水溶液中,空白組以蒸餾水代替保護(hù)劑,菌泥終濃度為5%,充分混勻后將菌泥平鋪在培養(yǎng)皿中,在超低溫冰箱中-20 ℃預(yù)凍5～6 h后進(jìn)行真空冷凍干燥,根據(jù)菌泥含水量估算干燥時(shí)間,主干燥階段-30 ℃;終干燥階段-40 ℃,最終菌粉水分<5%。凍干后測(cè)定用稀釋平板計(jì)數(shù)法[12]檢測(cè)活菌數(shù),根據(jù)公式(1)計(jì)算得存活率,考察凍干保護(hù)劑對(duì)菌體凍干存活率的影響[13]。

式(1)

1.2.2 凍干保護(hù)劑對(duì)菌體儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響 將添加不同保護(hù)劑冷凍干燥后的菌粉,分別在室溫放置4個(gè)月,在4 ℃和-20 ℃放置1年,每月檢測(cè)菌粉的活菌數(shù),從而考察不同凍干保護(hù)劑對(duì)菌體儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響。

1.2.3 益生元的篩選 以MRS培養(yǎng)基作為對(duì)照,試驗(yàn)組分別用2%低聚半乳糖、2%低聚果糖和2%菊粉替代MRS培養(yǎng)基中的葡萄糖,其他成分不變。將活化后的菌液以2%(V/V)接種量接入各培養(yǎng)基,37 ℃靜置恒溫發(fā)酵10 h后檢測(cè)發(fā)酵液中的活菌數(shù),確定出最適益生元[14]。

1.2.4 微膠囊的制備

1.2.4.1 制備乳化液 無菌操作條件下,準(zhǔn)確稱取菊粉和全蛋液,加水混勻,使菊粉終濃度為2%,全蛋液終濃度為20%;再加入5%菌泥攪拌均勻;后加入不同濃度(終濃度0.3%、0.5%、1%、1.5%)的海藻酸鈉溶液繼續(xù)攪拌,至形成均勻乳化液[8,15]。

1.2.4.2 固化 用噴霧干燥機(jī)在壓力0.2～0.3 MPa,流速30 mL/min(水)的條件下將乳化液噴入含有不同濃度CaCl2(終濃度1%、2%、2.5%)和0.5%殼聚糖乙酸溶液中,固化30 min,形成微膠囊[8,15]。

1.2.4.3 干燥 固化處理后,8000 r/min離心10 min,立即進(jìn)行冷凍干燥,即得成品。其中冷凍干燥時(shí),先-20 ℃預(yù)凍5 h,主干燥階段-30 ℃;終干燥階段-40 ℃,最終菌粉水分<5%[8,15]。

1.2.4.4 微膠囊包封率的測(cè)定 1%海藻酸鈉與全蛋液制備乳化液后,再于2.5%氯化鈣溶液中固化,通過考馬斯亮藍(lán)比色法[16]測(cè)定固化液中剩余蛋白的含量,根據(jù)公式(2)計(jì)算得包封率,篩選出最優(yōu)包埋組合[15]。

包封率(%)=(總?cè)榈鞍譕D值-上清液中乳蛋白OD值)/總蛋白OD值

式(2)

1.2.5 微膠囊釋放特性的測(cè)定

1.2.5.1 人工模擬液的制備 人工胃液:鹽酸16.4 mL,胃蛋白酶10 g,加水?dāng)噭蚝蠖ㄈ葜?000 mL,pH=1.5。

人工腸液:磷酸二氫鉀6.8 g,加水500 mL溶解,用0.4%的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH至6.8,另取胰酶10 g加水適量使其溶解,將兩液混合后,加水定容至1000 mL。

1.2.5.2 微膠囊在人工模擬液的耐酸性試驗(yàn)和腸溶性試驗(yàn) 耐酸性試驗(yàn):稱1 g微膠囊加入裝有100 mL人工胃液的三角瓶中,于搖床中以(37±1) ℃、150 r/min處理,0、0.5、1.0、1.5、2、2.5 h取樣用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的OD值,測(cè)其透光率,根據(jù)透光率變化分析人工胃液中微膠囊的溶出情況[17]。

透光率=(人工胃液實(shí)時(shí)OD值-人工胃液初始OD值)/人工胃液初始OD值

腸溶性試驗(yàn):稱1 g微膠囊加入裝有100 mL人工腸液的三角瓶中于搖床中以(37±1) ℃、150 r/min崩解。分別于 15、30、45、60 min取樣用分光光度計(jì)測(cè)定600 nm波長(zhǎng)下的OD值,根據(jù)透光率的變化分析人工腸液中微膠囊的溶出情況。于試驗(yàn)終點(diǎn)測(cè)定模擬腸液中的活菌數(shù)[17]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0進(jìn)行方差分析,結(jié)果均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,組間比較采用單因素方差分析,兩兩比較采用t檢驗(yàn),以p<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 凍干保護(hù)劑種類的篩選

菌體冷凍干燥后其活力變化的結(jié)果如圖1所示:菌體不加凍干保護(hù)劑直接凍干后存活率僅為12.7%,說明冷凍干燥過程對(duì)菌體活力的影響較大;而不同保護(hù)劑對(duì)菌體均有極顯著的保護(hù)作用(p<0.01),其作用大小排序?yàn)?20%全蛋液>10%脫脂奶粉>10%豆粉>10%乳糖>20%香蕉,其中添加20%全蛋液后的凍干存活率是無保護(hù)劑時(shí)的5倍。

圖1 不同凍干保護(hù)劑對(duì)菌體凍干后活力的影響Fig.1 Effects of different freeze-dried protective agentson the viability of mycelia after freeze 注:**代表與空白對(duì)照組數(shù)據(jù)之間差異極顯著(p<0.01)。

2.2 凍干保護(hù)劑對(duì)凍干菌粉儲(chǔ)藏穩(wěn)定性的影響

在應(yīng)用雙層包埋技術(shù)以提高益生菌數(shù)量和質(zhì)量的穩(wěn)定性時(shí),是在益生菌表面先包覆蛋白質(zhì),然后再包一層特殊膠體[4],可見,蛋白質(zhì)除了為凍干保護(hù)劑外,還考慮用作微囊的壁材,因此,進(jìn)一步考察富含蛋白質(zhì)的脫脂奶粉、豆粉和全蛋液作為凍干保護(hù)制備菌體凍干粉后的儲(chǔ)藏穩(wěn)定性。試驗(yàn)結(jié)果見圖2。

添加不同保護(hù)劑后制得的凍干菌粉,在室溫條件貯存,活菌數(shù)逐月下降,且第1個(gè)月下降速率較快,然后逐漸趨緩,貯存3個(gè)月時(shí)添加不同保護(hù)劑的菌體活菌數(shù)均已降至106cfu/g,4個(gè)月后各菌粉活菌數(shù)均已降至103cfu/g以下,于觀察終點(diǎn),以20%全蛋液為保護(hù)劑制得的凍干菌粉活菌數(shù)最多。

添加不同保護(hù)劑后制得的凍干菌粉在4 ℃貯存1年的過程中,前6個(gè)月活菌數(shù)均較穩(wěn)定,從第7個(gè)月開始有逐月下降的趨勢(shì);其中,全蛋液為保護(hù)劑時(shí),活菌數(shù)下降速率比另外兩種保護(hù)劑制得的菌粉活菌數(shù)下降更快,但得益于其起始活菌數(shù)高于后兩者,儲(chǔ)存1年后,其活菌數(shù)仍最多。

添加不同保護(hù)劑后制得的凍干菌粉,在-20 ℃條件下貯存較穩(wěn)定,貯存1年后活菌數(shù)均維持在1010cfu/g以上。同時(shí)試驗(yàn)結(jié)果也表明,以全蛋液為保護(hù)劑制得的凍干菌粉,儲(chǔ)存1年后的活菌數(shù)均較10%脫脂奶粉和10%豆粉為保護(hù)劑制得的凍干菌粉多。

綜上所述,以20%全蛋液為凍干保護(hù)劑制得的凍干菌粉凍干存活率最高,且置不同溫度的儲(chǔ)存條件下,于考察時(shí)間終點(diǎn)其菌粉活菌數(shù)均為最高,因此選取20%全蛋液為最佳凍干保護(hù)劑。

2.3 益生元的篩選

用不同的益生元代替培養(yǎng)基中的葡萄糖后,均能作為碳源被菌體所利用,其中2%菊粉效果最好,發(fā)酵后活菌數(shù)略高于原培養(yǎng)基,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,結(jié)果詳見圖3。因此,考慮將菊粉添加至微膠囊包埋的乳化液中,以促進(jìn)活菌釋放后的生長(zhǎng)。

圖3 添加不同益生元對(duì)菌株的生長(zhǎng)促進(jìn)作用Fig.3 Growth promoting effects of different prebiotics on 注:**:與2%葡萄糖組相比差異極顯著,p<0.01。

2.4 微膠囊包材對(duì)包封率的影響

制得的微膠囊包封率檢測(cè)結(jié)果如圖4所示:海藻酸鈉在0.3%～1%濃度范圍內(nèi)的相同濃度下,隨著氯化鈣濃度的升高,包封率逐漸增大;當(dāng)海藻酸鈉濃度達(dá)1.5%時(shí),隨著氯化鈣的濃度升高,包封率反而下降;這可能跟溶液粘稠度有關(guān),海藻酸鈉濃度越高,溶液越粘稠,越不利于與氯化鈣的充分接觸,難以形成均一的保護(hù)層。

圖4 菌體微膠囊包封率的測(cè)定Fig.4 Determination of encapsulation

當(dāng)海藻酸鈉濃度為1.5%,氯化鈣濃度為1%時(shí),微膠囊包埋率最高,達(dá)78.09%;當(dāng)海藻酸鈉濃度為1%,氯化鈣濃度為2.5%時(shí),微膠囊亦具有良好的包埋作用,包埋率達(dá)77.60%;將兩者數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn),不具統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。綜合考慮包埋液添加菌泥后的濃稠度,最終選取海藻酸鈉濃度為1%,氯化鈣濃度為2.5%為最優(yōu)包埋組合。

2.5 微膠囊特性的測(cè)定

2.5.1 微膠囊耐酸性試驗(yàn)結(jié)果 由圖5可看出微膠囊在人工胃液中透光率的變化情況:微囊與人工胃液接觸0.5 h后,透光率顯著下降(p<0.05),1 h后則趨勢(shì)變緩,隨后各時(shí)間點(diǎn)抽樣檢測(cè)結(jié)果與1 h比較,無顯著差異(p>0.05),整個(gè)處理過程透光率變化幅度不大,約5%。因此可以證明益生菌微膠囊能夠耐受胃液的破壞[18]。

圖5 微膠囊的耐酸性Fig.5 Acid resistance of microcapsules注:*:與0 h相比差異顯著,p<0.05;**:與0 h相比差異極顯著,p<0.01。

2.5.2 微膠囊腸溶性試驗(yàn)結(jié)果 由圖6可知,微囊與模擬腸液接觸45 min后透光率基本保持不變,且45 min和60 min后透光率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,表明微膠囊中的益生菌在模擬腸液中45 min內(nèi)釋放完畢[18]。于試驗(yàn)終點(diǎn)測(cè)定模擬腸液中的活菌數(shù),結(jié)果見表1,益生菌釋放完畢后,模擬腸液活菌數(shù)為原微囊活菌數(shù)的65.6%。

圖6 微膠囊的腸溶性Fig.6 Enteric solubility of microcapsules

表1 R8微囊置模擬腸液中的存活率Table 1 The survival rate of probiotic in microcapsule under simulated intestinal

3 結(jié)論

采用噴霧法制備耐受胃液且具有腸道定向釋放功能的副干酪乳桿菌R8微膠囊的最佳包埋液配方為:5%益生菌、2%菊粉、20%全蛋液、1%海藻酸鈉;最佳固化液配方為:2.5% CaCl2。

副干酪乳桿菌R8與全蛋液、海藻酸鈉混和均勻,進(jìn)行第一層包埋,益生菌作為芯材被分散在壁材內(nèi)部和表面;然后在進(jìn)行固化的過程中,殼聚糖將首層的包埋材料覆膜,最終制得涂層基質(zhì)型微膠囊。經(jīng)上述工藝制得微膠囊可耐受胃液破壞,在模擬腸環(huán)境中45 min內(nèi)釋放完畢;益生菌釋放完畢后,模擬腸液活菌數(shù)為原微囊活菌數(shù)的65.6%。

據(jù)試驗(yàn)結(jié)果可見,全蛋液既為凍干保護(hù)劑,亦為包埋壁材,在制備工藝過程起到保護(hù)作用,并提高在儲(chǔ)存過程中的穩(wěn)定性;將菌體/蛋白質(zhì)/海藻酸鈉微膠囊進(jìn)一步用殼聚糖材料進(jìn)行覆膜,可實(shí)現(xiàn)在腸道定向釋放的目的。