方 晨，梅詠玉，王 晶，楊 彬，劉曉昌，許建明，梅 俏

(安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院消化內(nèi)科，安徽省消化病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽 合肥 230022)

炎癥性腸病(inflammatory bowel disease, IBD)是一種病因尚不完全明確的慢性腸道炎癥性疾病。IBD的發(fā)病機(jī)制可能與遺傳、感染、環(huán)境、免疫等因素有關(guān)，其中，黏膜免疫異常在IBD的持續(xù)腸道炎癥過(guò)程中具有重要作用[1]。

IBD治療的主要方向是恢復(fù)促炎因子與抗炎因子之間的平衡[1]，調(diào)節(jié)腸道黏膜免疫異常。在腸道免疫功能的調(diào)節(jié)過(guò)程中，炎癥小體的活化發(fā)揮重要影響，其中NOD樣受體家族3(NOD-like receptor protein 3, NLRP3)炎癥小體是目前研究最廣泛的炎癥小體，參與了炎癥性疾病的發(fā)生、發(fā)展。Zhang等[2]研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3基因多態(tài)性與IBD風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。NLRP3炎癥小體是一種多蛋白復(fù)合物，負(fù)責(zé)IL-1β和IL-18的蛋白水解成熟和分泌。NLRP3炎癥小體由NLRP3、凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白[apoptosis associated speck-like protein containing a caspase activation and recruitment domain(CARD)，ASC]和胱天蛋白酶 1(caspase-1)組成，被激活時(shí)，NLRP3受體通過(guò)ASC聚合并募集和活化pro-caspase-1，活化的caspase-1切割無(wú)活性的pro-IL-1β和pro-IL-18，并以成熟形式分泌，加重IBD中腸道炎癥過(guò)程[3]。

炎癥消退是炎癥過(guò)程的重要調(diào)控機(jī)制，由一系列抗炎介質(zhì)控制，其中消退素 D1(resolvin D1，RvD1)是體內(nèi)重要的促炎癥消退因子。RvD1最早由小鼠腹腔炎性滲出物中分離，是由ω3- 二十二碳六烯酸(DHA)衍生的內(nèi)源性抗炎和促進(jìn)炎癥消退的脂質(zhì)分子。RvD1發(fā)揮限制中性粒細(xì)胞黏附與浸潤(rùn)、限制炎癥損傷等作用[4]。Bento等[5]、Norling等[6]在結(jié)腸炎、關(guān)節(jié)炎等方面研究均證明RvD1可以改善組織炎癥，保護(hù)相關(guān)器官功能，但RvD1抗結(jié)腸炎的具體機(jī)制尚不十分清楚。因此，本研究通過(guò)探討RvD1對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥過(guò)程中NLRP3信號(hào)通路的影響，為RvD1抗結(jié)腸炎作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物C57BL/6小鼠32只，♂，6～8周齡，體質(zhì)量(18～22) g，購(gòu)自安徽省動(dòng)物中心，No.34000200001280。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，溫度(20～26) ℃，相對(duì)濕度40%～70%。

1.2試劑葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate, DSS)，美國(guó)Sigma公司；RvD1，美國(guó)Cayman公司；髓過(guò)氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)試劑盒，南京建成生物工程研究所；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α試劑盒，均購(gòu)自武漢新啟迪生物科技有限公司；抗誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、pro-IL-1β抗體，均購(gòu)自Bioss生物科技有限公司；抗β-actin抗體，北京中杉生物科技有限公司；DNA合成試劑盒，美國(guó)Thermo Scientific公司；QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒，德國(guó)Qiagen公司。

1.3儀器EPS 300型電泳儀(上海天能科技有限公司)；TS-1000水平搖床(海門(mén)市其林貝爾儀器制造有限公司)；K960型PCR儀(杭州晶格科學(xué)儀器有限公司)；PikoReal 96型熒光定量PCR儀(Thermo Scientific公司)；高速臺(tái)式冷凍離心機(jī)(安徽嘉文儀器裝備有限公司)；Elx800型酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Tek公司)；752N型可見(jiàn)紫外分光光度計(jì)(上海精密科學(xué)儀器有限公司)。

2 方法

2.1模型的制備與實(shí)驗(yàn)分組按Chu等[7]方法，使用DSS建立小鼠實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎模型。實(shí)驗(yàn)分為4組：A組為正常組，小鼠自由飲水，并腹腔注射生理鹽水；B組為RvD1對(duì)照組，小鼠自由飲水并腹腔注射RvD1；C組為DSS模型組，小鼠給予5% DSS溶液自由飲用，并腹腔注射生理鹽水；D組為RvD1給藥組，小鼠給予5% DSS溶液自由飲用，并腹腔注射RvD1。將RvD1溶于生理鹽水，分別于d 2、4、6進(jìn)行小鼠腹腔注射(50 μg·kg-1)。實(shí)驗(yàn)d 8處死所有小鼠，分離血清于-80 ℃保存，同時(shí)收集小鼠小腸和結(jié)腸組織，待測(cè)樣品液氮儲(chǔ)存。

2.2結(jié)腸炎程度評(píng)估實(shí)驗(yàn)期間每天觀察小鼠體質(zhì)量、大便性狀和便血情況，進(jìn)行疾病活動(dòng)指數(shù)(disease activity index，DAI)評(píng)分[8]。大便隱血檢測(cè)采用潛血檢測(cè)試紙進(jìn)行。將取出的結(jié)腸組織用福爾馬林固定并石蠟包埋，切片厚4 μm，HE染色，進(jìn)行組織學(xué)指數(shù)(histological index，HI)評(píng)分[9]。用生理鹽水制備10%結(jié)腸組織勻漿。按ELISA試劑盒說(shuō)明，檢測(cè)結(jié)腸組織勻漿中MPO活性。

2.3小腸黏膜通透性檢測(cè)按文獻(xiàn)方法[10]制備小腸腸囊，注入伊文思藍(lán)0.2 mL，置于20 mL Krebs液燒杯中，95% O237 ℃水浴，30 min后取出腸囊組織，生理鹽水沖洗腸腔，37 ℃干燥，加入1 mL甲酰胺溶液，50 ℃孵育24 h，取出腸組織，溶液離心沉淀，取上清液進(jìn)行紫外分光光度計(jì)檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為655 nm。

2.4透射電鏡觀察將小腸組織于2.5%戊二醛中4 ℃固定6 h，1%鋨酸固定，梯度濃度乙醇脫水，環(huán)氧樹(shù)脂包埋，70 nm切片，JEM-1230F電子顯微鏡觀察小鼠小腸黏膜上皮細(xì)胞連接情況。

2.5結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平測(cè)定按ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、IL-10和TNF-α水平。

2.6Westernblot檢測(cè)結(jié)腸組織中相關(guān)蛋白的表達(dá)從結(jié)腸組織中提取蛋白質(zhì)，使用SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移至PVDF膜。在室溫下用封閉液(5%脫脂乳)封閉2 h。將膜與一抗在4 ℃孵育過(guò)夜，一抗包括ASC、NLRP3、caspase-1、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS(1 ∶300)及β-actin(1 ∶1 000)。TBST洗滌，將HRP連接的二抗在室溫下與膜孵育2 h。再次洗滌，使用ECL蛋白質(zhì)印跡檢測(cè)系統(tǒng)和ImageJ軟件檢測(cè)分析結(jié)果。

2.7qPCR檢測(cè)小鼠結(jié)腸組織IL-1β、iNOSmRNA表達(dá)使用TRIzol試劑從巨噬細(xì)胞和結(jié)腸組織中提取總RNA。用RevertAidTMM-MuLV逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，合成DNA第一鏈，并按DNA合成試劑盒的說(shuō)明，將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。使用QuantiNova SYBR Green PCR試劑盒擴(kuò)增獲得的cDNA用于定量PCR。以β-actin作為內(nèi)參，測(cè)量目的基因相對(duì)表達(dá)。引物序列(正向和反向)為：β-actin：5′-AGTGTG ACGTTGACATCCGT-3′和5′-TGCTAGGAGCCAGAG CAGTA-3′; iNOS：5′-CCTTGTTCAGCTACGCCTTC-3′和5′-CTTCAGAGTCTGCCCATTGC-3′; IL-1β：5′-GA AGAAGAGCCCATCCTCTG-3′和5′-TCATCTCGGAGC CTGTAGTG-3′。

3 結(jié)果

3.1RvD1對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥的影響與正常組小鼠相比，模型組小鼠DAI評(píng)分、HI評(píng)分、MPO水平明顯升高(Fig 1A、1B、1C)，病理可見(jiàn)結(jié)腸中大量中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，隱窩明顯減少，并累及部分上皮細(xì)胞(Fig 1D)；RvD1組小鼠DAI評(píng)分、HI評(píng)分及MPO水平明顯降低，病理可見(jiàn)結(jié)腸中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)減少，隱窩數(shù)量基本正常，表明RvD1可以改善DSS結(jié)腸炎小鼠中結(jié)腸炎癥損傷程度。

3.2RvD1對(duì)結(jié)腸炎小鼠腸黏膜屏障功能的影響如Fig 2所示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠小腸腸囊中伊文思藍(lán)濃度明顯上升，電鏡可見(jiàn)小腸上皮細(xì)胞絨毛雜亂，密度不均，細(xì)胞間連接增寬；RvD1組小鼠小腸腸囊中伊文思藍(lán)濃度降低，電鏡可見(jiàn)上皮絨毛稍稀疏，但排列規(guī)整，細(xì)胞間隙基本正常，表明RvD1可改善DSS引起的小鼠小腸結(jié)構(gòu)和功能破壞。

3.3RvD1對(duì)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織勻漿IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α水平的影響Tab 1結(jié)果顯示，與正常組小鼠相比，模型組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平增高，IL-10水平降低；與模型組小鼠相比，RvD1組小鼠結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平降低，IL-10水平增加。提示RvD1可調(diào)節(jié)DSS結(jié)腸炎小鼠腸黏膜中細(xì)胞因子水平，發(fā)揮抗結(jié)腸損傷作用。

Fig 1 Effect of RvD1 on colonic inflammation in DSS-induced colitis

A:DAI scoring; B: HI scoring; C: MPO activity; D: Histopathologic features of the colon. a: Normal group; b: RvD1 control group; c: Model group;d: RvD1 group.*P<0.05vsnormal group;#P<0.05vsmodel group.

3.4RvD1對(duì)DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中NLRP3炎癥小體表達(dá)的影響通過(guò)Western blot及qPCR檢測(cè)結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸NLRP3炎癥小體相關(guān)標(biāo)志物，包括ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20。如Fig 3所示，與正常組小鼠比較，模型組小鼠結(jié)腸中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1p20水平升高；與模型組小鼠比較，RvD1組小鼠結(jié)腸中ASC、NLRP3、IL-1β、pro-IL-1β、iNOS、caspase-1 p20水平降低。表明RvD1可降低NLRP3炎癥小體信號(hào)通路中主要標(biāo)志物的表達(dá)水平，改善結(jié)腸炎小鼠腸道炎癥程度。

Fig 2 Effect of RvD1 on intestinal barrier function and structure in DSS-induced colitis mice

*P<0.05vsnormal group,#P<0.05vsmodel group

Tab 1 Effect of RvD1 on contents of IL-1, IL-6, IL-10 and TNF-α in DSS-induced colitis

*P<0.05vsnormal;#P<0.05vsmodel

4 討論

IBD治療藥物包括氨基水楊酸制劑、糖皮質(zhì)類(lèi)激素、免疫抑制劑和各種生物制劑(如TNF-α單抗等)，這些藥物長(zhǎng)期使用會(huì)引起明顯的副作用，如激素依賴、骨髓抑制和嚴(yán)重感染。因此，探討更為安全有效的抗結(jié)腸炎藥物是目前IBD研究的熱點(diǎn)之一。

RvD1作為消退素家族中的一員，在體內(nèi)起到重要的抗炎作用，其機(jī)制與限制中性粒細(xì)胞黏附與浸潤(rùn)有關(guān)[4]。相關(guān)研究證實(shí)RvD1具有改善組織炎癥，保護(hù)器官功能的作用[5-6]，但RvD1抗結(jié)腸炎的具體機(jī)制尚不十分清楚。本研究結(jié)果顯示，腹腔注射RvD1可明顯降低實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠的DAI和HI評(píng)分，降低結(jié)腸組織中MPO水平。同時(shí)發(fā)現(xiàn)RvD1具有維持腸上皮完整性和通透性的作用。表明RvD1可以有效改善實(shí)驗(yàn)性小鼠結(jié)腸炎的炎癥損傷。另外，RvD1可以降低結(jié)腸組織中IL-1、IL-6、TNF-α水平，升高IL-10水平，發(fā)揮調(diào)節(jié)細(xì)胞因子水平的作用。

IL-1β在結(jié)腸炎癥的促炎因子釋放中起重要作用，可以上調(diào)IL-6、TNF-α等促炎因子的表達(dá)，擴(kuò)大和加重結(jié)腸炎癥損傷。NLRP3炎癥小體作為IL-1β成熟釋放的關(guān)鍵信號(hào)通路[11]，在腸道內(nèi)穩(wěn)態(tài)和炎癥中起重要作用，有研究顯示DSS可以激活巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體，用DSS或TNBS處理的NLRP3-/-小鼠結(jié)腸炎癥減輕，結(jié)腸組織中促炎細(xì)胞因子水平較低[12-13]。本研究發(fā)現(xiàn)，DSS模型組中NLRP3、ASC、caspase-1 p20表達(dá)量均明顯增加， IL-1β、iNOS水平增加；RvD1可以降低結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸組織中NLRP3、ASC、caspase-1 p20、IL-1β、iNOS表達(dá)，表明RvD1具有通過(guò)抑制NLRP3炎癥小體的活化，抑制促炎因子合成，改善小鼠結(jié)腸炎癥的作用。目前，有關(guān)NLRP3炎癥小體在實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎中的作用存在一定爭(zhēng)論。有研究顯示，NLRP3-/-小鼠對(duì)實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎更敏感[14-15]，原因可能為NLRP3作為先天性免疫的的重要組成部分，起到維持腸內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用，當(dāng)NLRP3功能缺失，造成腸道微生物紊亂引起的黏膜損傷，是IBD可能的致病機(jī)制之一，經(jīng)過(guò)抗生素處理的NLRP3-/-小鼠結(jié)腸炎癥減輕[15]。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RvD1可以減輕DSS結(jié)腸炎小鼠結(jié)腸炎癥的嚴(yán)重程度，保護(hù)腸道屏障功能，其機(jī)制可能與抑制NLRP3炎癥小體活化，調(diào)控促炎細(xì)胞因子表達(dá)有關(guān)，提示RvD1可作為治療IBD治療的潛在候選藥物。