段雨岑，施 蓓，鄭曉嬌，蘇詩萌，曹 宇

(1. 中國醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院生理學教研室，遼寧 沈陽 110122；2. 沈陽市婦嬰醫(yī)院生殖醫(yī)學科，遼寧 沈陽 110011)

機體的體溫是保持內環(huán)境穩(wěn)態(tài)的重要因素之一，除病理性體溫明顯升高或降低以外，通常還表現(xiàn)出體溫的生理性波動，特別是女性在月經(jīng)周期表現(xiàn)為雙相體溫的變化，即在卵泡期體溫較低，在排卵后基礎體溫升高約(0.3～0.6) ℃。關于月經(jīng)周期中的黃體期體溫升高的機制，通常認為是孕酮作用在下丘腦的體溫調節(jié)中樞，進而改變新陳代謝水平或皮膚血流量，但其作用的相關生物學機制還不清楚[1]。

瞬時受體電位香草酸受體4(transient receptor potential vanilloid 4,TRPV4)是瞬時受體電位(transient receptor potential,TRP)蛋白家族成員之一，是位于細胞膜上的一種重要的離子通道，參與體內多種生理功能的調節(jié)過程。目前的研究表明，該通道是一種多向的非選擇性陽離子通道，可透過Ca2+、K+、Mg2+和Na+，但Ca2+的通透率相對較高[2-3]。在體內，TRPV4可被多種刺激所激活，包括物理因素(如溫度、滲透壓等)、內源性和外源性化學因素(如特異性激動劑等)以及低pH值(pH<6)[4]。隨著對其溫度感受特性和滲透壓感受特性的研究，TRPV4已被視為體內的熱傳感器和滲透壓傳感器[5]。TRPV4通道在哺乳動物大多數(shù)組織中均有表達，包括外周神經(jīng)系統(tǒng)和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)主要表達在下丘腦、海馬、皮層等部位[6]。研究發(fā)現(xiàn)，在體溫調節(jié)中樞下丘腦前部有TRPV4的表達，且在機體的體溫調節(jié)過程中，特別是對正常體溫的維持起重要的作用[7]。本研究主要探討TRPV4是否參與♀大鼠性周期中孕酮致體溫升高的過程。通過預先在體溫調節(jié)中樞視前區(qū)-下丘腦前部(preoptic-anterior hypothalamus area,PO/AH)給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734[8-9]，觀察RN-1734對大鼠動情后期體溫的影響；進一步在去卵巢大鼠腹腔注射孕酮后，于PO/AH區(qū)給予RN-1734，觀察體溫的變化，以明確體溫升高與孕酮及TRPV4通道的關聯(lián)性。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 SPF級健康♀SD大鼠，體質量240～260 g，由中國醫(yī)科大學實驗動物中心提供，動物合格證和使用許可證號分別為:SCXK(遼)013-0001、SYXK(遼)013-0007。飼育室溫度(20 ± 2)℃，晝夜光照節(jié)律12 h ∶12 h，相對濕度40%～60%，單籠飼養(yǎng)，自由進食水。實驗前，將動物在實驗環(huán)境中適應1周。以下實驗每組均采用6只動物。

1.1.2試劑 孕酮、TRPV4特異性阻斷劑RN-1734，均購自MedChem Express公司。

1.1.3儀器 無線BW-200數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)(成都泰盟軟件有限公司)；化學發(fā)光免疫分析儀(SIEMENS IMMULITE?2000 XPI[1])。

1.2方法

1.2.1大鼠動情周期的觀察 每天于7 ∶30～8 ∶30開始，將待查♀鼠置于空籠子鐵絲蓋上，用拇指和食指捏住其尾，其余3指壓于后腰背部，露出陰道口，將小棉簽從陰道口插入陰道并且緩慢轉動，抽出后，將黏液均勻涂在載玻片上，待載玻片變干，進行HE染色，用顯微鏡觀察細胞類型的形態(tài)。并將♀大鼠隨機分為動情前期、動情期、動情后期和動情間期。

1.2.2觀察大鼠在性周期中的體溫變化及孕酮水平 應用生理無線遙測系統(tǒng)(BW-200)實時監(jiān)測大鼠體溫。將大鼠用10%水合氯醛(3 mg·kg-1)腹腔麻醉，放置在超凈臺內，仰臥位，四肢固定，腹部用酒精棉消毒，沿腹中線剪開，埋入體溫檢測發(fā)射子，將腹部縫好，用碘伏消毒傷口處，腹腔注射40 000 IU青霉素，處理完畢后，單獨飼養(yǎng)1周后，連續(xù)觀察兩個動情周期，監(jiān)測其體溫變化。之后分別在動情前期、動情期、動情后期和動情間期相應時相，取血液樣本，將樣本存放在抗凝管中，經(jīng)3 000 r·min-1水平離心10 min，取上清液(即血漿)，置入EP管，-70 ℃保存。然后，將取上清液，用化學發(fā)光法檢測血中孕酮濃度。

1.2.3觀察不同孕酮水平對去卵巢大鼠體溫的影響 去卵巢大鼠模型：大鼠麻醉后俯臥位，以肋下1 cm、脊柱旁2 cm處為中心除毛，切開皮膚。在皮膚和肌肉之間擴張、剝離，見包繞卵巢的脂肪組織及緊密相連的子宮，將其拉出，在子宮角的輸卵管的部位結扎，切斷子宮角，將卵巢摘除后，撒以青霉素粉，分別縫合腹膜與肌層和皮膚。飼育1周后，通過觀察陰道分泌物，以明確無明顯動情周期。連續(xù)觀察10 d(約兩個動情周期)體溫變化，確認體溫平穩(wěn)之后，將大鼠隨機分為：① 正常對照組(Control)：腹腔注射0.1 mL生理鹽水；② 溶劑組(Solvent)：腹腔注射0.1 mL溶劑(乙醇 ∶麻油=1 ∶4)；③ 孕酮組(Progesterone，用上述溶劑溶解)：腹腔注射孕酮(1 、5、25 mg·kg-1)各0.1 mL，觀察不同劑量孕酮對機體體溫的影響。

1.2.4觀察PO/AH給予RN-1734對正常大鼠動情后期體溫波動的影響 將大鼠腹腔麻醉后，暴露前囟。在顱骨冠狀縫下0.3 mm、矢狀縫旁0.8 mm處鉆孔，將高度為6.4 mm引導管垂直插入PO/AH區(qū)，固定導管。單籠飼養(yǎng)1周后，連續(xù)觀察兩個動情周期大鼠的體溫，明確動情后期出現(xiàn)體溫最高點的時相，在動情后期體溫到達最高點前2 h(通過前期實驗表明阻斷劑RN-1734在第2 h作用最大)，于PO/AH區(qū)分別注射1 μL的生理鹽水、溶劑(乙醇 ∶芝麻油=1 ∶4)和阻斷劑RN-1734(0.002 3 μg·kg-1，用上述溶劑溶解),觀察不同實驗條件下的體溫波動情況。

1.2.5在預先給予孕酮的去卵巢大鼠的PO/AH給予RN-1734，觀察體溫波動的變化 將去卵巢大鼠隨機分為4組：① 正常對照組(Control)：腹腔注射0.1 mL溶劑(乙醇 ∶芝麻油=1 ∶4)，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL溶劑；② 阻斷劑組(RN-1734)：腹腔注射0.1 mL溶劑，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL阻斷劑RN-1734(0.002 3 μg·kg-1)；③ 孕酮組(Progesterone)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH區(qū)注射1 μL溶劑；④ 孕酮+阻斷劑組(Progesterone+RN-1734)：腹腔注射0.1 mL孕酮(5 mg·kg-1)，10 h后，在PO/AH注射RN-1734阻斷劑1 μL(0.002 3 μg·kg-1)。觀察不同實驗條件下，大鼠的體溫波動變化。

2 結果

2.1陰道涂片確定大鼠動情周期取大鼠陰道分泌物，經(jīng)涂片、HE染色，顯微鏡下觀察各個時期的特點如下：動情前期可見大量圓形有核細胞(Fig 1A)；動情期可見大量不規(guī)則角化細胞(Fig 1B)；動情后期可見圓形有核細胞、角化細胞、白細胞3種細胞并存(Fig 1C)；動情間期可見大量體積小的白細胞(Fig 1D)。

Fig 1 HE staining of vaginal secretion on rats(scale bar: 100 μm)

A:Proestrus; B: Oestrus; C: Metestrus; D: Diestrus.

Tab 1 Progesterone concentration in blood and temperature change of rats in estrus

2.3去卵巢大鼠給予不同劑量孕酮時的體溫變化Fig 2顯示了給予去卵巢大鼠孕酮(1、5、25 mg·kg-1)、溶劑和正常對照組的體溫變化情況。結果表明，給予孕酮后，出現(xiàn)了劑量依賴性體溫升高，即劑量越大，體溫升高幅度越大。實驗表明，給藥12 h后體溫升高幅度最大，依據(jù)孕酮劑量由低至高，其體溫分別達到(39.31±0.06)℃、(39.48±0.07)℃、(39.58±0.08)℃，在給藥24 h后，體溫基本恢復為基礎體溫。Tab 2為不同實驗條件下，各個時間點體溫與基礎體溫(實驗前1周，應用生理無線遙測系統(tǒng)，每隔5 min記錄1次體溫，取其時間點平均值記為基礎體溫)的差值，其中孕酮給藥濃度為5、25 mg·kg-1，體溫均在6 h和12 h時間點存在差異。

2.4大鼠動情后期在PO/AH給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734后其體溫的變化如Fig 3所示，♀大鼠進入動情后期體溫開始明顯升高，體溫最高達(38.77±0.05)℃。然而，在PO/AH給予生理鹽水或溶劑時，兩組間動情后期體溫變化無明顯差異。通過前期實驗發(fā)現(xiàn)，RN-1734在注射后第2 h發(fā)揮作用最明顯，所以選擇大鼠動情后期體溫到達最高點前2 h，在PO/AH區(qū)給予RN-1734。通過阻斷劑組與正常對照組和溶劑組比較，發(fā)現(xiàn)阻斷劑組體溫升高幅度明顯降低，體溫低至(38.23±0.06)℃，各個時間點的體溫變化差值為大鼠動情后期體溫升高的幅度(Tab 3)。從表中可看出，通過與動情期的體溫進行對比，RN-1734組注射后的1～5 h，體溫升高幅度明顯降低。

Fig 2 Curve of temperature change in ovariectomized rats administered with different concentrations of

Fig 3 Curve of temperature change on rats in metestrus after injecting specific antagonist

2.5去卵巢大鼠分別給予孕酮和/或RN-1734的體溫變化如Fig 4所示，去卵巢大鼠腹腔注射孕酮(5 mg·kg-1)12 h后，體溫明顯升高，達到高峰，體溫最高達(39.58±0.08)℃。給予孕酮(5 mg·kg-1)后10 h，在PO/AH區(qū)給予RN-1734，體溫升高幅度明顯下降，體溫為(39.10±0.10)℃。在未給予孕酮的去卵巢大鼠PO/AH區(qū)注射阻斷劑RN-1734，體溫升高幅度亦下降，但預先給予孕酮的去卵巢大鼠給予阻斷劑后，體溫下降較未給予孕酮的去卵巢大鼠更明顯[12]。此外，Tab 4結果顯示，在PO/AH區(qū)注射阻斷劑RN-1734后，預先給予孕酮后12 h和14 h，大鼠體溫升高幅度的下降較未給予孕酮(溶劑對照)的去卵巢大鼠明顯(P<0.05)。

3 討論

機體的體溫水平是影響新陳代謝活動的重要內在條件，體溫過高會直接導致蛋白質變性、細胞膜結構破壞；而體溫過低則影響代謝活動、興奮的傳導等生理功能反應。因此，體溫作為基本的生命體征之一，維持其相對穩(wěn)定至關重要。在育齡期女性，體溫隨月經(jīng)周期的波動也具有其特定的生理意義，排卵前體溫降低，為精子進入女性體內提供適宜的溫度環(huán)境，而此后的體溫升高則有利于受精卵的發(fā)育等生殖過程。一直以來，對于排卵后體溫升高機制的認識還只限于明確了與孕激素水平有關，更詳細的分子生物學機制還所知甚少。

Tab 2 Change of temperature in ovariectomized rats administered with different concentrations of

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 3 Change of temperature on rats in metestrus after injecting specific antagonist

*P<0.05,**P<0.01vscontrol

Tab 4 Change of body temperature of ovariectomized rats after injecting progesterone and/or specific antagonist

*P<0.05,**P<0.01vs

Fig 4 Curve of body temperature change on ovariectomized rats administered with progesterone and/or specific antagonist

TRPs蛋白家族的發(fā)現(xiàn)，對于多種感覺功能的生物學機制有了更深入的認識。其中，與溫度感受有關的TRPs分子的相繼被發(fā)現(xiàn)，提供了揭示機體體溫調節(jié)的分子生物學機制的研究線索。作為TRPs蛋白家族成員之一的TRPV4在大多數(shù)哺乳動物及人體的多種組織細胞中均有表達，在成人背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia,DRG)，有關TRPV4通道的溫敏特性的研究已取得了較多的成果[10]。TRPV4通道通過與多種物質結合發(fā)揮作用，其中包括微管結合蛋白、水通道蛋白-4、水通道蛋白-5、小窩蛋白-1等，使Ca2+濃度增加，進而調節(jié)生理功能活動。

目前已經(jīng)證明，在PO/AH區(qū)體溫調節(jié)中樞有TRPV4的表達，該通道蛋白的敏感溫度為35 ℃以上。研究證明，正常體溫條件下，阻斷TRPV4可出現(xiàn)體溫降低[11]。我們推測，育齡期女性基礎體溫在排卵后出現(xiàn)升高期，很可能與TRPV4的功能活動有關。為此，在本研究中，首先驗證了在月經(jīng)周期中大鼠體溫的變化與孕酮水平的相關性，進而通過采用PO/AH區(qū)給予TRPV4特異性阻斷劑RN-1734抑制TRPV4通道活性的方法[12-13]，觀察了TRPV4對♀大鼠性周期體溫波動的影響，結果可見給予特異性阻斷劑后，大鼠動情后期體溫升高的幅度明顯降低。同時，我們還制備了去卵巢大鼠模型，觀察不同濃度孕酮致大鼠呈現(xiàn)劑量依賴性體溫升高的基礎上，也觀察到RN-1734能夠降低孕酮致體溫升高的幅度，進一步說明了孕酮致體溫升高與TRPV4通道功能的關聯(lián)性。

綜上所述，在PO/AH區(qū)采用TRPV4通道特異性阻斷劑RN-1734能夠抑制孕酮致♀大鼠體溫升高的作用，提示了體溫調節(jié)中樞中的TRPV4通道可能參與了在動情后期孕酮致體溫升高的過程，但相關的更詳細的細胞內信號轉導過程及細胞反應分子機制，還需要進一步深入研究。