鐘 磊，師健友，白 蘭

(1. 四川省醫(yī)學(xué)科學(xué)院·四川省人民醫(yī)院藥學(xué)部；2. 電子科技大學(xué)附屬醫(yī)院·四川省人民醫(yī)院個(gè)體化藥物治療四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610072)

食管癌是最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，在中國(guó)人群中的致死率位居所有腫瘤的第5位[1]。大部分食管癌患者在發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期，化療是這類(lèi)病人的主要治療手段。近年來(lái)，有關(guān)食管癌治療靶點(diǎn)和藥物的研究已取得了不少進(jìn)展，然而，食管癌患者預(yù)后仍然較差，發(fā)現(xiàn)有效的治療靶點(diǎn)和藥物仍是食管癌治療亟待解決的問(wèn)題。

組蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)在多種類(lèi)型的腫瘤中過(guò)表達(dá)，其表達(dá)量與腫瘤預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是多種腫瘤的治療靶點(diǎn)[2-4]。Nakagawa等[5]研究發(fā)現(xiàn)，HDAC1/2/3/8在食管癌組織中的表達(dá)量要明顯高于正常組織；一項(xiàng)系統(tǒng)性評(píng)價(jià)和Meta分析的研究也顯示，胃腸道腫瘤的病人，包括食管癌患者，HDAC1表達(dá)水平與病人預(yù)后密切相關(guān)，較低的HDAC1表達(dá)量意味著較好的存活率[6]。由此可見(jiàn)，HDACs也是治療食管癌的潛在靶點(diǎn)。本研究探討了一種高活性的pan-HDAC抑制劑JNJ-26481585的抗食管癌作用及其部分作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞株 食管癌細(xì)胞株TE-1，購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)。

1.1.2藥物與試劑 JNJ-26481585、順鉑(cis-dichlorodiammineplatinum，DDP)、5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)，購(gòu)自美國(guó)Selleck公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胰酶、MTT、結(jié)晶紫、DMSO，購(gòu)自Sigma公司；胎牛血清，購(gòu)自Corning公司；EdU增殖檢測(cè)試劑盒Cell-LightTMEdu Apollo 567 In Vitro Kit，購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Annexin V/PI凋亡檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)有限公司；Ac-H3K9、P21抗體，購(gòu)自英國(guó)Abcam公司；p-Akt、Akt、p-ERK、ERK抗體，購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司；β-actin抗體、辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.1.3儀器 Heraeus BB15型細(xì)胞培養(yǎng)箱、Multiscan MK3酶標(biāo)儀(美國(guó)ThermoFisher公司)；BHC-1000IIA/B3型生物安全柜(蘇凈安泰生物技術(shù)有限公司)；IX50型倒置顯微鏡(日本Olympus公司)；FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國(guó)Becton Dicknson公司)；JY300C型電泳儀(北京君意東方電泳儀器有限公司)。

1.2方法

1.2.1MTT檢測(cè)細(xì)胞活力 在96孔板接種TE-1細(xì)胞，次日加入濃度為10、3、1、0.3、0.1、0.03、0.01、0.003 μmol·L-1的JNJ-26481585、DDP和5-FU處理細(xì)胞72 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)復(fù)孔。隨后加入20 μL濃度5 g·L-1的MTT溶液，37 ℃孵育4 h，再加入50 μL濃度為200 g·L-1的酸性SDS溶液溶解甲臜過(guò)夜，最后采用酶標(biāo)儀于570 nm波長(zhǎng)檢測(cè)吸光度值。根據(jù)公式(X/C)×100%計(jì)算經(jīng)藥物處理后腫瘤細(xì)胞的存活率，其中，C和X分別代表溶劑對(duì)照組和藥物處理組的平均吸光度值，使用Graphpad Prism軟件做細(xì)胞存活率-藥物濃度曲線圖。

1.2.2克隆形成實(shí)驗(yàn) 在12孔板接種TE-1細(xì)胞，每孔5000個(gè)。次日加入JNJ-26481585(1、0.1、0.01 μmol·L-1)處理細(xì)胞，2～3 d換液1次。作用10 d后棄上清，用甲醇固定細(xì)胞15 min，再用0.25%的結(jié)晶紫染液染色。

1.2.3EdU檢測(cè)細(xì)胞增殖 96孔板接種細(xì)胞，每孔8 000個(gè)。次日加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h，并設(shè)置溶劑對(duì)照組。后續(xù)EdU標(biāo)記增殖細(xì)胞，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.2.4細(xì)胞周期檢測(cè) 6孔板接種細(xì)胞，次日加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，并采用70%乙醇固定過(guò)夜，加入50 mg·L-1碘化丙啶(PI)、100 mg·L-1RNase和0.1% Triton X-100在暗處作用30 min，隨后上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.5Annexin V/PI染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡 按“1.2.4”項(xiàng)方法接種和處理細(xì)胞，隨后按照試劑盒操作說(shuō)明，向每管加入500 μL Binding buffer重懸細(xì)胞，再依次分別加入5 μL Annexin V-FITC和PI，混勻，室溫避光反應(yīng)5～15 min，及時(shí)上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.6劃痕實(shí)驗(yàn) 24孔板接種細(xì)胞，待細(xì)胞融合度達(dá)80%左右時(shí)，用滅菌黃槍尖在每孔均勻劃痕，并加入JNJ-26481585(1、0.3、0.1 μmol·L-1)處理細(xì)胞。對(duì)照組細(xì)胞愈合時(shí)結(jié)束實(shí)驗(yàn)，在倒置顯微鏡下拍照。

1.2.7Transwell細(xì)胞侵襲檢測(cè) 將Transwell小室插入24孔板，并鋪上一層按1 ∶6比例稀釋的基質(zhì)膠。待基質(zhì)膠凝固后，在小室內(nèi)接種細(xì)胞，并加入無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋的JNJ-26481585或溶劑對(duì)照共同孵育，小室外孔內(nèi)加入含血清的完全培養(yǎng)基。24 h后用甲醇固定小室底部侵襲的細(xì)胞，再用0.05%結(jié)晶紫染色。

1.2.8Western blot實(shí)驗(yàn) 收集經(jīng)JNJ-26481585處理18 h 后的TE-1細(xì)胞，RIPA裂解，超聲，提取總蛋白。采用SDS-PAGE分離蛋白，并轉(zhuǎn)至PVDF膜，脫脂奶粉封閉2 h，加入1 ∶1 000稀釋的一抗4 ℃孵育過(guò)夜。次日，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，隨后洗去過(guò)量抗體，加入顯影液曝光。

2 結(jié)果

2.1JNJ-26481585抑制TE-1細(xì)胞活力JNJ-26481585的結(jié)構(gòu)見(jiàn)Fig 1A，采用MTT法檢測(cè)其對(duì)食管癌細(xì)胞TE-1活力的影響。如Fig 1B所示，JNJ-26481585可有效抑制TE-1細(xì)胞活力，且抑制作用具有濃度依賴性，IC50值為0.073 μmol·L-1。DDP和5-FU作為臨床食管癌化療一線用藥，對(duì)TE-1細(xì)胞的IC50均大于10 μmol·L-1，活性弱于JNJ-26481585。進(jìn)一步采用克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)JNJ-26481585對(duì)TE-1細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，F(xiàn)ig 1C結(jié)果顯示，在0.1 μmol·L-1及以上濃度時(shí)，JNJ-26481585可明顯抑制TE-1細(xì)胞生長(zhǎng)，無(wú)明顯細(xì)胞克隆產(chǎn)生。

2.2JNJ-26481585抑制TE-1細(xì)胞增殖進(jìn)一步采用EdU染色檢測(cè)JNJ-26481585對(duì)TE-1細(xì)胞增殖的影響，EdU(紅色熒光)標(biāo)記增殖活力強(qiáng)的細(xì)胞。如Fig 1D所示，藥物處理組EdU標(biāo)記的細(xì)胞明顯少于溶劑對(duì)照組，表明JNJ-26481585具有較強(qiáng)的抗細(xì)胞增殖活性。

2.3JNJ-26481585誘導(dǎo)G2/M期細(xì)胞周期阻滯Fig 2A的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示，經(jīng)JNJ-26481585處理的食管癌細(xì)胞，處于G2/M期的細(xì)胞數(shù)量隨著藥物濃度的增加而逐漸增多，在較低濃度(0.1 μmol·L-1)時(shí)即可明顯誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞G2/M期阻滯。

2.4JNJ-26481585誘導(dǎo)TE-1細(xì)胞凋亡如Fig 2B所示，與溶劑對(duì)照組相比，藥物處理組均可明顯增加Annexin V陽(yáng)性的凋亡細(xì)胞數(shù)，表明JNJ-26481585還可通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡來(lái)抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。

2.5JNJ-26481585抑制TE-1細(xì)胞遷移和侵襲HDAC的異常表達(dá)與腫瘤轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，為進(jìn)一步評(píng)估JNJ-26481585對(duì)食管癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移的影響，對(duì)藥物處理前后，TE-1細(xì)胞的遷移和侵襲(腫瘤轉(zhuǎn)移中的兩個(gè)關(guān)鍵環(huán)節(jié))能力進(jìn)行了檢測(cè)。如Fig 3所示，JNJ-26481585可劑量依賴性地抑制劃痕的愈合和TE-1細(xì)胞侵襲穿過(guò)基質(zhì)膠，表明JNJ-26481585還具有較強(qiáng)的抗轉(zhuǎn)移活性。

Fig 1 JNJ-26481585 inhibited growth of TE-1 cells in n=3)

A: Structure of JNJ-26481585; B: Anti-viability assay of JNJ-26481585, DDP and 5-FU against TE-1 cells. The ordinate represents the survival rate of tumor cells; C: Long-term colony formation assay of JNJ-26481585-treated TE-1 cells; D:Edu cell proliferation assay on TE-1 cells after treatment with 1 μmol·L-1JNJ-26481585 for 24 h.**P<0.01vscontrol.

Fig 2 JNJ-26481585 induced G2/M phase arrest and apoptosis in TE-1 n=3)

A: Influence of JNJ-26481585 on cell cycle progression in TE-1 cells. The statistical analysis of cell cycle is presented on the right; B: Apoptosis detection was performed using Annexin V/PI co-staining, and the percentage of Annexin V-positive cells is quantified for apoptotic rate statistics.**P<0.01vscontrol.

2.6JNJ-26481585的抗食管癌分子機(jī)制Fig 4的Western blot結(jié)果顯示，JNJ-26481585可明顯增加HDAC底物H3K9的乙?；健Ｗ鳛榧?xì)胞周期抑制劑，p21表達(dá)量在腫瘤細(xì)胞中受到表觀調(diào)控而降低[7]，而經(jīng)JNJ-26481585處理的TE-1細(xì)胞，p21表達(dá)水平明顯提高。此外，JNJ-26481585還可明顯抑制Akt和ERK的磷酸化，這兩個(gè)蛋白分別是PI3K/mTOR和MAPK信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白，與腫瘤細(xì)胞的凋亡和增殖密切相關(guān)。

Fig 3 JNJ-26481585 inhibited migration and invasion of TE-1 cells in n=3)

A: The representative images (×20) from vehicle and 1 μmol·L-1JNJ-26481585 treated groups in wound healing assay. The number of migrated cells is used for statistics and quantified by manual counting; B: The representative images (×20) from vehicle and 1 μmol·L-1JNJ-26481585 treated groups in Transwell invasion assay. The number of invaded cells is counted for statistics.*P<0.05,**P<0.01vscontrol.

Fig 4 The anti-esophageal cancer molecular mechanisms of JNJ-26481585

TE-1 cells were treated with JNJ-26481585 or vehicle control for 18 h, then cells were lysed and the proteins were analyzed by immunoblot.

3 討論

越來(lái)越多的證據(jù)顯示，除了基因突變外，表觀遺傳調(diào)控也參與了腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展[8-9]。HDACs作為一類(lèi)重要的表觀遺傳修飾酶，參與了多種組蛋白和非組蛋白底物的去乙酰化修飾，其異常激活與多種腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后密切相關(guān)，被認(rèn)為是治療腫瘤的潛在靶點(diǎn)。目前，已有多種HDACs抑制劑被批準(zhǔn)上市，用于T細(xì)胞淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤的治療，包括伏立諾他、羅米地辛、貝林司他、西達(dá)本胺、帕比司他等[10-11]。然而，由于藥物本身的活性和藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)等原因，大部分HDACs抑制劑在實(shí)體瘤治療中的療效并不令人滿意。本研究所使用的JNJ-26481585是一種高活性的pan-HDAC抑制劑，對(duì)I型HDAC酶均有較高的抑制活性，且具有較好的藥代動(dòng)力學(xué)性質(zhì)，在實(shí)體瘤治療中具有一定優(yōu)勢(shì)[12]。本文的研究結(jié)果也顯示，JNJ-26481585在較低濃度時(shí)即可明顯抑制食管癌細(xì)胞的活力和增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡，此外，還具有抑制細(xì)胞遷移和侵襲的作用，顯示了較強(qiáng)的抗食管癌活性。

HDACs可調(diào)控組蛋白和多種非組蛋白底物的去乙?；?，故HDACs抑制劑的抗腫瘤分子機(jī)制較復(fù)雜，不同的HDACs抑制劑在不同的腫瘤類(lèi)型中抗腫瘤作用機(jī)制也有差異。大量研究顯示，HDAC1可特異性沉默細(xì)胞周期抑制劑p21[7,12]，抑制HDACs可以阻斷多種腫瘤生長(zhǎng)相關(guān)信號(hào)通路，如Akt/mTOR、MAPK/ERK等[13-14]。因此，本研究主要檢測(cè)了JNJ-26481585對(duì)p21表達(dá)和這兩條腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)依賴的信號(hào)通路的影響。結(jié)果顯示，JNJ-26481585在較低濃度即可明顯上調(diào)p21表達(dá)水平，并抑制PI3K/mTOR和MAPK通路中的關(guān)鍵蛋白Akt和ERK的磷酸化。這一結(jié)果表明JNJ-26481585的抗食管癌作用涉及到多種分子機(jī)制，上調(diào)p21，以及抑制Akt/mTOR、ERK信號(hào)在其中發(fā)揮重要作用。

綜上所述，本研究報(bào)道了一種高活性的pan-HDAC抑制劑JNJ-26481585的抗食管癌作用及其作用機(jī)制，JNJ-26481585可通過(guò)上調(diào)細(xì)胞周期抑制劑p21表達(dá)，以及抑制Akt/mTOR、ERK信號(hào)通路，進(jìn)而抑制食管癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。