李靜平，顧 雯，倪藝榕，柯 瑾

(1. 云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，云南 昆明 650500；2. 華南師范大學(xué)生物光子學(xué)研究院，廣東 廣州 510631)

糖尿病(diabetes mellitus，DM)創(chuàng)面難愈與糖代謝障礙關(guān)系密切，是臨床常見(jiàn)、治療棘手的并發(fā)癥。其發(fā)病機(jī)制目前尚未完全清楚，DM是一個(gè)多因素、多環(huán)節(jié)參加的復(fù)雜病理過(guò)程，形成經(jīng)久不愈的頑固性潰瘍、易感染等一系列糖尿病皮膚病變。嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，耗費(fèi)大量醫(yī)療資源和資金[1]，臨床亟待低毒、高效的治療方法及藥物。

前期臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，我們發(fā)現(xiàn)以傳統(tǒng)抗腫瘤、抗疲勞、提高免疫等為主要活性的天然藥物人參皂苷Rg3，能促進(jìn)DM皮損患者及糖尿病大鼠難愈創(chuàng)面模型的皮損修復(fù)，且愈合良好。Rg3可有效改善創(chuàng)面炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、促進(jìn)肉芽組織形成、縮短愈合時(shí)間、提高創(chuàng)面愈合率[2]。其修復(fù)DM皮損作用是獨(dú)立于傳統(tǒng)藥效之外的額外收益，值得深入探索。本研究擬在前期初步藥效基礎(chǔ)上，探索Rg3對(duì)DM難愈創(chuàng)面大鼠表皮細(xì)胞(厚度及增殖周期)和創(chuàng)面血管新生的影響，為其修復(fù)DM難愈創(chuàng)面的機(jī)制研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物♂ SD大鼠，體質(zhì)量(180～200) g，動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(川)2015-030，動(dòng)物合格證號(hào)：51203500004561，購(gòu)自由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2藥物與試劑Rg3(純度98.2%)，由中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植物化學(xué)研究室提供；氨基胍(aminoguanidirig，AG)，購(gòu)自昆明市泉港生物科技有限公司。鏈脲佐菌素(streptozocin， STZ)、Dispase Ⅱ分散酶(貨號(hào)：4010ES60)，美國(guó)Sigma公司；蘇木精、伊紅(貨號(hào)：C0105-1)，碧云天生物公司；CD31抗體(貨號(hào)：555025)，BD公司；二抗孵育試劑盒(貨號(hào)：PV-9000)、DAB試劑盒(貨號(hào)：ZLI-9018)，中杉金橋科技；胎牛血清(fetal bovine serum，F(xiàn)BS)，索萊寶公司，貨號(hào)：C1010。

1.3儀器SQ2125切片機(jī)(Leica公司)；Lab.A1光學(xué)正置顯微鏡(蔡司公司)；GHP-9050N隔水式培養(yǎng)箱(Thermo公司)；CytoFLEX流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter公司)。

2 方法

2.1動(dòng)物模型的建立及實(shí)驗(yàn)分組Ⅱ型DM模型建立[3-4]：大鼠高脂飼料喂養(yǎng)4周，一次性腹腔注射低劑量STZ 40 mg·kg-1(0.1 mol·L-1檸檬酸緩沖液配制，pH 4.4)；正常組腹腔注射等體積的檸檬酸緩沖液。72 h后測(cè)空腹血糖及血清中胰島素水平，并采用HOMA法計(jì)算胰島素敏感指數(shù)，胰島素敏感指數(shù)=22.5/(空腹血糖×胰島素)。空腹血糖≥16.0 mmol·L-1及胰島素敏感指數(shù)≤正常動(dòng)物均值，為造模成功，有待進(jìn)一步造難愈傷口模型。將上述DM大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組、Rg3高、低劑量組、AG組，另設(shè)正常組。Rg3組分別灌胃Rg3 15、5 mg·kg-1；AG組灌胃10 mg·kg-1；模型組、正常組給予等劑量生理鹽水，每日1次。

AG為一種小分子親核性肼類(lèi)化合物，是目前研究最多的一種糖基化終末產(chǎn)物(advanced glycation end products，AGEs)抑制劑。大量體外及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，其與葡萄糖中間體，如二羰基化合物相互作用，抑制糖基化和AGEs的生成及長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)下AGEs介導(dǎo)的組織損害[5]。因本項(xiàng)目擬研究Rg3改善皮膚局部AGEs蓄積，調(diào)節(jié)由AGEs直接介導(dǎo)的皮膚組織自身細(xì)胞或基質(zhì)功能不良，促進(jìn)DM皮損修復(fù)的作用機(jī)制，故將AG作為陽(yáng)性對(duì)照藥。

難愈傷口模型的建立：給藥4周后，各組動(dòng)物背部皮膚全層等面積切除，造創(chuàng)面模型。戊巴比妥鈉按體質(zhì)量45 mg·kg-1腹腔注射麻醉，背部剃毛，自制無(wú)菌的直徑2 cm圓形硬紙片在脫毛處作標(biāo)記，剪除全層皮膚。術(shù)后每只動(dòng)物單籠喂養(yǎng)，期間各實(shí)驗(yàn)組繼續(xù)給藥直至取材。

2.2檢測(cè)指標(biāo)及方法

2.2.1動(dòng)物處理及標(biāo)本采集 傷后21 d，分別每組斷頸處死大鼠，取新鮮創(chuàng)緣皮膚組織，①HE染色，觀察皮膚組織形態(tài)學(xué)改變；②Image J圖像分析軟件測(cè)量真皮層和表皮層厚度；③消化后分離表皮與真皮，流式細(xì)胞儀檢測(cè)表皮細(xì)胞增殖周期，用Lysis軟件分析細(xì)胞周期；④以抗血小板-內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子(CD31)單克隆抗體，對(duì)皮膚樣本進(jìn)行免疫組化染色，Image-Pro Plus6.0圖像分析軟件計(jì)算陽(yáng)性染色區(qū)域占視野面積的百分比，反映血管生成情況。

2.2.2創(chuàng)面皮膚組織HE染色觀察 取創(chuàng)緣皮膚組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，HE染色，光鏡下觀察創(chuàng)面組織炎癥反應(yīng)、膠原改變、壞死組織存留，以及脫落、新生上皮匍行等形態(tài)學(xué)變化。

2.2.3皮膚組織表皮層和真皮層厚度測(cè)量 HE染色后，鏡檢拍照，經(jīng)Image J圖像分析軟件數(shù)據(jù)分析，測(cè)量大鼠表皮層和真皮層厚度。

2.2.4表皮細(xì)胞增殖周期檢測(cè) 新鮮樣本離體后，剪去皮下組織，修剪成直徑0.5 cm的皮塊，經(jīng)Dispase Ⅱ消化后，分離表皮及真皮，離心取上清液，0.1 mol·L-1PBS+10% FBS終止反應(yīng)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)，Lysis軟件分析表皮細(xì)胞周期。

2.2.5CD31表達(dá)率檢測(cè) 免疫組化法檢測(cè)DM全層皮膚損傷大鼠創(chuàng)面皮膚組織CD31蛋白的表達(dá)率，反映新生血管形成情況。4%多聚甲醛固定皮膚樣本，石蠟包埋切片，抗原修復(fù)，滅活內(nèi)源性過(guò)氧化物酶活性，滴加鼠抗人CD31一抗(1 ∶100)，4 ℃孵育過(guò)夜，PBS沖洗3次，滴加二步法免疫組化檢測(cè)試劑的二抗(1 ∶100)，37 ℃孵育20 min，PBS沖洗3次，DAB顯色5 min，蘇木精復(fù)染，37 ℃孵育5 min，鹽酸酒精分化1～3 s，封片，免疫熒光顯微鏡下觀察染色結(jié)果并采集圖片，用Image-Pro Plus6.0軟件分析陽(yáng)性染色區(qū)域的強(qiáng)度并量化：每張圖片取3個(gè)高倍視野，統(tǒng)計(jì)后求平均值，平均陽(yáng)性細(xì)胞率=陽(yáng)性區(qū)域面積/總面積×100%。

3 結(jié)果

3.1創(chuàng)面皮膚組織形態(tài)學(xué)改變?nèi)鏔ig 1所示，正常組傷后21 d的創(chuàng)面表皮完全再生，無(wú)殘留創(chuàng)面，可見(jiàn)大量呈紡錘形成纖維細(xì)胞，膠原排列整齊，規(guī)則，真皮層可見(jiàn)大量毛細(xì)血管。與正常組比較，模型組皮膚菲薄，成纖維細(xì)胞少且無(wú)明顯增殖，表皮細(xì)胞層次少，真皮層膠原明顯水腫，皮下脂肪消失；創(chuàng)面炎性細(xì)胞較多，且浸潤(rùn)緩慢而持久，壞死組織脫落及創(chuàng)面肉芽組織形成緩慢，新生血管形成較少。與模型組比較，AG組創(chuàng)面上皮組織覆蓋較多，成纖維細(xì)胞增加，細(xì)胞增殖明顯，表皮及真皮均一定程度增厚，見(jiàn)清晰的表皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)，膠原較多且排列較整齊，炎癥細(xì)胞減少，壞死組織脫落，出現(xiàn)創(chuàng)緣細(xì)胞匍行，新生血管數(shù)量較多，肉芽組織較厚。Rg3高、低劑量組大多創(chuàng)面上皮組織完全覆蓋，表皮增厚，表皮細(xì)胞層次清晰，真皮層增厚，成纖維細(xì)胞較多，膠原較多且排列較整齊。Rg3低劑組有一定的細(xì)胞增加和表皮增厚作用，但較高劑組不明顯。Rg3高、低劑量組創(chuàng)面炎癥細(xì)胞明顯減少，壞死組織形成脫落較早，創(chuàng)緣細(xì)胞匍行出現(xiàn)較早，真皮下毛細(xì)血管較多，肉芽組織形成較厚。

Fig 1 Wound skin tissue on 21st day after injury(HE×100)

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.

3.2表皮層和真皮層厚度比較Tab 1結(jié)果顯示，模型組表皮及真皮較正常組變薄(P<0.01)，Rg3組表皮、真皮厚度較模型組明顯增厚(P<0.01)。

Tab 1 Thickness of epidermis and

**P<0.01vscontrol;##P<0.01vsmodel

3.3表皮細(xì)胞增殖周期變化模型組較正常組G0/G1期比例明顯升高(P<0.01)，對(duì)應(yīng)的G2/M、S期比例降低(P<0.01)，提示模型組動(dòng)物表皮細(xì)胞周期停滯于DNA準(zhǔn)備期，細(xì)胞增殖減慢。AG組G0/G1期比例較模型組有所下降，S、G2/M期比例有升高趨勢(shì)(P<0.05)，表明AG可能通過(guò)抑制AGEs而促進(jìn)表皮細(xì)胞增殖。Rg3高、低劑量組較模型組G0/G1期比例下降，且高劑量組下降明顯(P<0.05)，S、G2/M期比例升高(P<0.05，P<0.01)，提示Rg3可有效改善DM創(chuàng)面皮膚表皮細(xì)胞增殖異常狀況，高劑量組效果較明顯(Fig 2、Tab 2)。

GroupG0/G1SG2/MControl66.6±0.730.3±0.93.1±0.6Model85.1±0.5??12.7±0.4??2.2±0.1AG79.9±0.6#18.0±0.6#1.7±0.2Rg3 low dose82.5±2.013.6±0.4#1.6±0.1Rg3 high dose72.8±0.4##25.1±1.1##3.9±0.2#

*P<0.05,**P<0.01vscontrol,#P<0.05,##P<0.01vsmodel

3.4創(chuàng)面組織CD31的表達(dá)如Fig 3所示，模型組創(chuàng)面CD31蛋白表達(dá)率明顯低于正常組(P<0.01)，AG組和Rg3高劑量組CD31蛋白表達(dá)高于模型組(P<0.05)。

4 討論

DM患者最大的威脅來(lái)自并發(fā)癥，也是DM治療中尤為重要的部分。其中，DM自發(fā)性皮膚損傷(如DM潰瘍、DM性水皰等)或外源性創(chuàng)傷所致皮膚創(chuàng)面難愈，成為患者最常見(jiàn)、嚴(yán)重的并發(fā)癥之一。美國(guó)創(chuàng)面協(xié)會(huì)資料顯示，約70% DM皮膚難愈創(chuàng)面患者即使經(jīng)過(guò)6個(gè)月治療和護(hù)理，仍無(wú)明顯改善[6]。因此，尋求治療的新策略和新藥物既是全球性的挑戰(zhàn)，也有利于節(jié)約相關(guān)醫(yī)療資源。

Fig2Epidermalcellproliferationcycleinrats

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.

Fig 3 Expression of CD31 in rat skin tissues(×100)

A：Control; B：Model; C：AG; D：Rg3 low dose; E：Rg3 high dose.**P<0.01vscontrol,#P<0.05vsmodel.

Rg3是存在于天然藥物人參或三七中的一種四環(huán)三萜皂苷，具有抗腫瘤、抗疲勞、舒張血管、提高免疫力等多種藥理活性[7]，但從未有過(guò)其在皮損修復(fù)方面的相關(guān)活性報(bào)道。前期臨床及實(shí)驗(yàn)證實(shí)，Rg3對(duì)DM難愈創(chuàng)面有修復(fù)作用，能提高愈合率、縮短愈合時(shí)間[2]。本研究意在深入探討其修復(fù)DM皮損的作用機(jī)制，以期發(fā)現(xiàn)其獨(dú)立于傳統(tǒng)抗癌活性以外的新藥效。

與以往的報(bào)道一致[8]，本實(shí)驗(yàn)HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組較正常組皮膚菲薄，表皮細(xì)胞層次少，真皮層膠原水腫，伴不同程度的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，皮下脂肪消失。Rg3組創(chuàng)面炎癥反應(yīng)帶消退，炎癥細(xì)胞明顯減少，血管增生、肉芽組織形成及膠原較多，創(chuàng)緣細(xì)胞匍行出現(xiàn)較早。用藥后大鼠真皮及表皮層厚度均增厚，提示Rg3可部分逆轉(zhuǎn)皮膚病理改變，一定程度上改善DM皮膚的易損狀態(tài)。另外，皮膚細(xì)胞保持著一定的增殖率，以維持正常新陳代謝需要和表皮結(jié)構(gòu)完整[9]。檢測(cè)表皮細(xì)胞周期發(fā)現(xiàn)，模型大鼠表皮細(xì)胞停滯于G0/G1期(DNA準(zhǔn)備期)比例升高，S期(DNA合成期)的比例及G2/M期(有絲分裂期)比例明顯低于正常組。提示在DM狀態(tài)下，皮膚表皮細(xì)胞的增殖生物學(xué)行為受擾，不能有效、有序地完成細(xì)胞增殖，從而成為皮膚菲薄的細(xì)胞生物學(xué)基礎(chǔ)之一。Rg3組G0/G1期比例下降，S、G2/M期比例升高，提示其能抑制表皮細(xì)胞生長(zhǎng)停滯期，激活增殖期，進(jìn)而改善創(chuàng)面皮膚異常的表皮細(xì)胞增殖，有利于創(chuàng)面愈合。

患者糖代謝障礙所致糖蛋白沉積于血管內(nèi)皮，引起血管基底膜增厚，可導(dǎo)致微循環(huán)障礙。血管病變加之神經(jīng)病變、免疫功能低下等多因素，促使DM皮膚創(chuàng)面易反復(fù)感染[10]。同時(shí)，創(chuàng)面愈合過(guò)程涉及炎癥反應(yīng)、肉芽組織形成等方面，而肉芽組織形成是創(chuàng)面愈合的關(guān)鍵階段，其可修復(fù)創(chuàng)面組織缺損，清除壞死組織[11]。新生血管有助于氧氣和養(yǎng)料供應(yīng)，促進(jìn)肉芽組織形成。新生血管越多，肉芽組織生長(zhǎng)越快，則創(chuàng)面愈合時(shí)間縮越短[12]。CD31蛋白主要表達(dá)于血管內(nèi)皮細(xì)胞中，是新生血管形成的重要標(biāo)志。由CD31標(biāo)記的新生微血管密度是目前公認(rèn)的評(píng)價(jià)血管形成的標(biāo)準(zhǔn)。創(chuàng)面修復(fù)過(guò)程中，CD31能客觀、直接地反映創(chuàng)面血管生成及愈合程度。結(jié)果表明，Rg3高劑組創(chuàng)面CD31陽(yáng)性表達(dá)率高于模型組，提示其修復(fù)糖尿病性皮損可能與促進(jìn)創(chuàng)面血管生成有關(guān)。但有文獻(xiàn)報(bào)道，Rg3在抗腫瘤研究中，有抑制腫瘤異常血管生成的作用，以實(shí)現(xiàn)抗腫瘤和抑制腫瘤轉(zhuǎn)移目的[13]。此報(bào)道有異于本研究結(jié)果，我們研究表明Rg3可促進(jìn)糖尿病皮膚損傷創(chuàng)面血管生成而修復(fù)皮損。這可能是其獨(dú)立于其傳統(tǒng)抗腫瘤藥效之外的額外收益，即“老藥新用”。不同研究提示，Rg3對(duì)血管生成方面的作用值得深入探索，可能因疾病、機(jī)體組織及狀況而異，呈現(xiàn)抑制或促進(jìn)的不同活性。

本研究證實(shí)Rg3能抑制創(chuàng)面皮膚病理變化，增加皮膚表皮及真皮厚度，改善表皮細(xì)胞增殖周期異常狀況，促進(jìn)創(chuàng)面血管新生，為該藥物在修復(fù)DM難愈創(chuàng)面方面的機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

(致謝：感謝昆明市代謝性疾病中醫(yī)藥防治研究中心、云南中醫(yī)學(xué)院劉昌孝院士工作站及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心為本研究提供科研場(chǎng)所和儀器。謹(jǐn)向全體課題組成員及同學(xué)表示衷心感謝！同時(shí)也感謝中國(guó)科學(xué)院昆明植物研究所植化研究室提供實(shí)驗(yàn)用藥及幫助。)