楊澤霖，洪桂祝，張小琴，南麗紅，黃 鑫，林 昱，唐宇恒，劉俊杰，汪旭雯，賴文芳，褚克丹

(福建中醫(yī)藥大學藥學院，福建 福州 350122)

景天科植物紅景天(RhodiolaroseaL.)是我國歷史悠久的傳統(tǒng)中藥，具有益氣活血、治療胸痹心痛、中風偏癱等功效。紅景天苷是中藥紅景天的主要有效成分。課題組前期研究表明，紅景天苷對大鼠大腦中動脈閉塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)模型具有神經(jīng)保護作用[1-4]。在現(xiàn)階段的研究中，在炎癥反應中起重要作用的補體系統(tǒng)日益受到重視，受到過度激活的補體系統(tǒng)所產(chǎn)生的炎癥效應片段，是造成腦內(nèi)炎癥反應損傷的主要始動因素之一[5]。來源于鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤的PC12細胞具有神經(jīng)細胞的形態(tài)特征與功能，被廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究。CoCl2是一種常用的化學性低氧模擬劑，在多種細胞中能誘導低氧誘導因子(hypoxia inducible factor，HIF)的表達，模擬缺氧狀況，引起細胞缺氧、凋亡等相關反應[6]。本文主要研究紅景天苷對化學低氧損傷PC12細胞中C3、Egr1、Egr4表達的影響，觀察紅景天苷是否能夠逆轉PC12細胞的神經(jīng)損傷，探討紅景天苷神經(jīng)保護作用的分子機制。

1 材料

1.1細胞株PC12細胞，購自中國科學院上海生命科學研究院。

1.2藥品與試劑紅景天苷由福建中醫(yī)藥大學提供，純度≥98%；胎牛血清(HyClone，貨號：SV 30087.02)；Egr1(588)抗體(貨號：sc-110)、Egr4(U-25)抗體(貨號：sc-133540)、C3a受體拮抗劑(C3a receptor antagonist，C3aRA)(貨號：SC-222291)，均購自Santa Cruz公司；β-actin 抗體(碧云天生物技術有限公司，貨號：AA128)；Egr4 siRNA(Qiagen，貨號：SI01509025)；caspase-3 活性檢測試劑盒(Cell Signaling Technology，貨號：#5732S)；DeadEndTMFluorometric TUNEL System(美國Promega公司，貨號：G3250)；RNeasy? Mini Kit(QIAGEN，貨號：74104、74106)；RevertaidTMFirst Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，貨號：K1622)；TaqMan?Universal PCR Master Mix(Applied Biosystems，貨號：R11022)。

1.3儀器7900HT熒光定量PCR儀(Applied Biosystems公司)；Infinite M200 Pro多功能酶標儀(TECAN公司)；ChemiDoc XRS+凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad公司)。

2 方法

2.1細胞培養(yǎng)PC12 細胞接種在25 cm2細胞培養(yǎng)瓶中，加入含10%胎牛血清、1%青霉素、鏈霉素的改良型RPMI 1640培養(yǎng)液，置于37 ℃的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)、傳代。

2.2實驗分組與處理待PC12細胞處于對數(shù)生長期后，將其分為5組：正常對照組(Normal)、模型組(Model)、CoCl2+0.1 μmol ·L-1紅景天苷組、CoCl2+1 μmol ·L-1紅景天苷組、CoCl2+10 μmol ·L-1紅景天苷組。待細胞長到80%后，吸出舊培養(yǎng)基，用PBS洗1遍，模型組和給藥組中加入含CoCl2的培養(yǎng)基(CoCl2的終濃度為200 μmol·L-1)。之后給藥組立即加入相應濃度的紅景天苷，正常對照組加入相同的溶劑，細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集樣品待測。

2.3caspase-3活性的檢測PC12細胞以2×108·L-1的密度接種于96孔板，每孔加入100 μL，待細胞長到80%后，PBS洗1遍，經(jīng)CoCl2造模、紅景天苷給藥處理細胞48 h后，預冷的PBS漂洗1遍，加入25 μL試劑盒中的細胞裂解液，冰上靜置5 min，再加入200 μL Ac-DEVD-AMC( caspase-3四肽熒光底物)，于37 ℃ 避光孵育1 h后，在多功能酶標儀上測定熒光強度，激發(fā)波長380 nm，發(fā)射波長為420 nm，單位以相對熒光單位(relative fluorescence units，RFU) 表示。

2.4C3a受體拮抗劑實驗實驗分組：正常組(Normal)、正常+紅景天苷(1 μmol·L-1)組、模型組(Model)、模型+紅景天苷(1 μmol·L-1)組、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)組、模型+C3aRA(50 nmol·L-1)+紅景天苷(1 μmol·L-1)組。以2×108·L-1的細胞密度接種PC12細胞至24孔培養(yǎng)板中，每孔中加入不含抗生素的培養(yǎng)基0.5 mL，按照分組造模、給藥后，細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集樣品，檢測Egr4、Egr1 mRNA表達及caspase-3活性。

2.5Egr4siRNA干擾實驗實驗分組：正常組(Normal)、模型組(Model)、siRNA陰性對照組(Negative control)、紅景天苷組(Model+Salidroside組，紅景天苷終濃度為1 μmol·L-1)、Egr4 siRNA組(Model+Egr4 siRNA組，Egr4 siRNA終濃度為50 nmol·L-1)、Egr4 siRNA+紅景天苷組(Model+Egr4 siRNA+ Salidroside組，Egr4 siRNA終濃度為50 nmol·L-1，紅景天苷終濃度為1 μmol·L-1)。轉染前24 h，以2×108·L-1的細胞密度接種PC12細胞至24孔培養(yǎng)板中，每孔加入不含抗生素的培養(yǎng)基0.5 mL，使轉染時的細胞密度能夠達到30%～50%匯合度。按照分組造模給藥，其中siRNA組加入siRNA-lipofectamineTM2000(lipo2000)混合液混勻；作用6 h后，移去含有siRNA-lipo2000混合液的培養(yǎng)基，更換新鮮的培養(yǎng)基，且同時給予紅景天苷(終濃度1 μmol·L-1)，細胞繼續(xù)培養(yǎng)48 h后收集樣品，檢測C3 mRNA表達，Egr4、Bax、Bcl-xl蛋白表達及caspase-3活性。

2.6Westernblot檢測相關蛋白的表達提取細胞總蛋白，按照SDS-PAGE凝膠配制試劑盒說明書，配制合適濃度的分離膠。上樣，電泳至藍色帶剛好跑到凝膠底部時終止電泳。轉膜成功后TBS洗1遍，把PVDF膜浸泡在封閉液中，置于搖床上室溫封閉2 h。加入一抗Egr1 (1 ∶800)、Egr4(1 ∶600)、C3(1 ∶600)、β-actin(1 ∶3 000)，4 ℃孵育過夜。二抗室溫孵育2 h，PVDF膜用TBS洗滌(10 min×3次)，顯影。

2.7qPCR法檢測相關基因的表達提取細胞總RNA，逆轉錄成cDNA，以cDNA為模板，熒光定量PCR檢測各基因的表達。PCR引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，參照GenBank中大鼠Egr1、Egr4、C3的引物序列，Egr1引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR擴增片斷長度為128 bp；Egr4引物上游序列5′-AAGCTGGAGCAGGAAGAGGTTG-3′，下游序列5′-GCAGGGAGGAGGTTTTGGATAG-3′，PCR擴增片斷長度為161 bp；C3引物上游序列5′-AAAATGGAATCTCTACGAAGGTCA-3′，下游序列5′-AGTCGCAGGTCAATGAAGAAGTC-3′，PCR擴增片斷長度為128 bp。

3 結果

3.1紅景天苷對PC12細胞低氧損傷后caspase-3活性的影響如Fig 1所示，200 μmol·L-1CoCl2處理PC12細胞48 h后，與正常組比較，模型組中caspase-3活性明顯升高；經(jīng)不同濃度紅景天苷處理后，細胞caspase-3活性明顯下降，且呈劑量依賴性，10 μmol·L-1紅景天苷作用的效果最好。

3.2紅景天苷對PC12細胞低氧損傷后C3蛋白表達的影響如Fig 2所示，與正常組比較，模型組中C3蛋白高表達，經(jīng)不同濃度紅景天苷作用后，C3蛋白表達降低，且隨劑量的遞增，條帶的表達減弱。

3.3紅景天苷對PC12細胞低氧損傷后Egr4、Egr1蛋白表達的影響與正常組比較，模型組中Egr4、Egr1蛋白表達降低，經(jīng)不同濃度紅景天苷作用后，Egr4、Egr1蛋白表達增加(Fig 3)。

Fig 1 Effect of salidroside on activity of caspase-3 of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

Fig 2 Effect of salidroside on C3 protein expression of PC12 after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

**P<0.01vsmodel

3.4C3aRA對PC12細胞低氧損傷后caspase-3活性、Egr4、Egr1的影響PC12細胞低氧損傷模型經(jīng)C3aRA作用后，caspase-3活性降低，Egr4、Egr1 mRNA表達增加，與紅景天苷的作用沒有明顯差異(Tab 1)。這些結果表明，C3aRA對Egr4具有調控作用，進而對PC12細胞具有保護作用。

3.5Egr4siRNA在PC12細胞低氧損傷后對caspase-3活性、C3、Egr4、Bax、Bcl-xl的影響siRNA干擾PC12細胞低氧損傷模型中Egr4的表達后，導致caspase-3活性升高，Bax蛋白增加，Bcl-xl蛋白降低；經(jīng)紅景天苷作用后，能逆轉Egr4 siRNA所引起的基因表達的變化，但對C3沒有作用(Fig 4、5)。

Tab 1 Effect of C3aRA on activity of caspase-3, Egr4 and Egr1 mRNA expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury (fold of normal) n=6)

**P<0.01vsmodel

Fig 3 Effect of salidroside on Egr4 and Egr1 protein expression of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

*P<0.05,**P<0.01vsmodel

這些結果表明，Egr4對C3沒有調控作用，但紅景天苷能夠通過調控Egr4，進而對PC12細胞發(fā)揮保護作用。

4 討論

CoCl2誘導PC12細胞化學性低氧損傷模型，常用于神經(jīng)細胞缺氧的體外研究。CoCl2能夠誘導一些種類細胞里的HIF-1的表達，因此，可以作為PC12、HepG2等細胞株的化學性低氧模擬劑[7-8]。PC12細胞來源于鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤，具有神經(jīng)細胞的形態(tài)特征與功能，廣泛應用于神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究[9-11]。CoCl2誘導的PC12化學低氧損傷模型能夠模擬體內(nèi)腦缺氧情況，是體外研究神經(jīng)細胞缺氧的理想模型。本研究采用CoCl2誘導PC12化學性缺氧損傷發(fā)現(xiàn)，與正常組比較，模型組的Bax蛋白表達增加，Bcl-xl蛋白表達降低，caspase-3活性升高，經(jīng)紅景天苷作用后，能夠逆轉Bax、Bcl-xl蛋白的表達，以及caspase-3活性，表明紅景天苷能抑制PC12細胞因低氧損傷而導致的細胞凋亡。

Fig 4 Effect of Egr4 siRNA on Egr4 protein expression(A) and C3 mRNA expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;##P<0.01vsEgr4 siRNA.

Egr4是與神經(jīng)突觸可塑性相關的基因，本研究發(fā)現(xiàn)，Egr4 siRNA作用后，Bax蛋白表達增加，Bcl-xl表達降低，caspase-3活性升高，經(jīng)紅景天苷作用后，能夠逆轉該作用。且研究發(fā)現(xiàn)，Egr4 siRNA對C3作用不明顯。提示紅景天苷能夠促進Egr4的表達，進而抑制PC12細胞因低氧損傷而導致的細胞凋亡。

補體C3是激活補體系統(tǒng)4條途徑的共同樞紐，在激活促炎因子、誘發(fā)炎癥介質釋放、溶解靶細胞中扮演關鍵的角色?；罨蟮难a體C3在C3轉化酶的作用下，在蛋白水平酶解成具有過敏性毒素的C3a小片段和C3b，C3a進而與C3a受體結合，發(fā)揮過敏性毒素的作用，導致細胞破壞、溶解[13-14]。本研究通過使用C3aRA阻斷C3a/C3aR的結合。使用C3aRA后，PC12細胞的caspase-3活性降低，與紅景天苷作用相似，提示紅景天苷通過抑制補體C3/C3a受體，起到抗凋亡作用。且研究發(fā)現(xiàn)，拮抗C3a受體作用后，對Egr4具有調控作用。

Fig 5 Effect of Egr4 siRNA on activity of caspase-3(A), Bax and Bcl-xl protein expression(B) of PC12 cells after CoCl2-induced hypoxia injury n=6)

NC: Negative control; Egr4 siRNA: Model+Egr4 siRNA; Sal: Model+Salidroside; Egr4 siRNA+Sal: Model+Egr4 siRNA+ Salidroside.*P<0.05,**P<0.01vsmodel;#P<0.05,##P<0.01vsEgr4 siRNA.

綜上所述，本研究結果提示，紅景天苷對CoCl2誘導PC12細胞損傷模型具有神經(jīng)保護作用，與抑制補體成分C3，促進Egrs表達，進而抑制Bax蛋白表達及caspase-3的活性，促進Bcl-xl表達有關。