張歡歡，方 杰，毛詩瑩，楊 揚，謝 琿，余陳歡

(浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院浙江省實驗動物中心，浙江省實驗動物與安全性研究重點實驗室，浙江 杭州 310013)

BRAFV600E突變，即BRAF蛋白產(chǎn)物第600位的纈氨酸(V)被谷氨酸(E)替代，持續(xù)性激活下游MAPK信號通路，使細(xì)胞增殖異常，進(jìn)而引發(fā)腫瘤[1]。該突變首先在黑色素瘤中被發(fā)現(xiàn)，且呈高頻率突變的狀態(tài)，目前已經(jīng)成為黑色素瘤的治療靶標(biāo)[2]。然而，約10%結(jié)腸癌也存在BRAFV600E突變[3]，但由于我國結(jié)腸癌的發(fā)病率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于黑色素瘤，因而開發(fā)治療結(jié)腸癌BRAFV600E突變的靶向藥物更具有臨床價值和經(jīng)濟(jì)效益。

目前，臨床上常用的威羅菲尼、達(dá)拉菲尼等BRAFV600E抑制劑，能夠有效治療80%以上BRAFV600E突變型黑色素瘤[4]，但是對BRAFV600E突變型結(jié)腸癌的抑制效果卻不足5%[5]。近年來，BRAFV600E突變型結(jié)腸癌作為一種獨特的生物樣本，因其難以進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)的化療治療和嚴(yán)重的不良預(yù)后[6]，已成為目前結(jié)腸癌治療的重點。本研究通過慢病毒載體感染構(gòu)建BRAFV600E穩(wěn)定表達(dá)的CT26細(xì)胞穩(wěn)轉(zhuǎn)株，用于評價中藥化學(xué)成分庫中篩選所得的BRAFV600E高親和小分子抑制劑的體外抑癌活性，為中藥治療結(jié)腸癌的作用機(jī)制研究提供新的思路和方法，同時也為開發(fā)高效抑制BRAFV600E突變型結(jié)腸癌的藥物提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1細(xì)胞株與試劑小鼠結(jié)腸癌CT26細(xì)胞株，浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心保存。RPMI 1640培養(yǎng)基(BBI)；胎牛血清(Hyclone)；BRAFV600E慢病毒(PPL)；中藥單體化合物庫(TargetMol)；MTT(Sigma)；抗體BRAFV600E(26039，NewEast Biosciences)；MEK(4694S)、p-MEK(9154S)、p-ERK(4370S)抗體，均購自CST公司；ERK(16443-1-AP)、β-actin一抗(60008-1-Ig)，均購自Proteintech公司；蛋白marker(上海翊圣)。

1.2儀器CO2培養(yǎng)箱(Eppendorf)；熒光倒置顯微鏡(ZEISS)；多功能酶標(biāo)儀(MD)；流式細(xì)胞儀(BD公司)；電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad)；化學(xué)發(fā)光分析儀(Linex)。

1.3細(xì)胞培養(yǎng)及分組CT26細(xì)胞置于含10%胎牛血清的RPMI 1640 培養(yǎng)基中，在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，2～3 d傳代1次。設(shè)計引物擴(kuò)增含CT26細(xì)胞對應(yīng)人BRAFV600位點的序列，并進(jìn)行測序。

1.4BRAFV600E慢病毒感染CT26細(xì)胞取對數(shù)生長期CT26細(xì)胞，接種于6孔板，待細(xì)胞生長到匯合度為50%時，更換為1 mL新鮮培養(yǎng)基，將60 μL病毒滴度>1011PFU·L-1的BRAFV600E慢病毒與4 μL聚凝胺(Polybrene)預(yù)混后加到培養(yǎng)基，37 ℃、5% CO2培養(yǎng)條件下繼續(xù)培養(yǎng)48 h，加入4 mg·L-1嘌呤霉素篩選1周，獲得BRAFV600ECT26穩(wěn)轉(zhuǎn)株。

1.5細(xì)胞增殖檢測細(xì)胞接種于96孔板，每孔5 000個，每組處理6個復(fù)孔，分別在d 1、2、3每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。棄舊液，每孔加入150 μL二甲基亞砜，避光放置30 min，至紫色結(jié)晶完全溶解。多功能酶標(biāo)儀在490 nm處測量吸光值。

1.6細(xì)胞劃痕實驗取兩組對數(shù)生長期細(xì)胞接種于6孔板，待細(xì)胞匯合度為90%，用滅菌槍頭在孔板底部單層細(xì)胞的中央劃出一劃痕，PBS洗去死細(xì)胞后，顯微鏡下拍照，并于24 h后觀察細(xì)胞生長狀態(tài)并拍照。ImageJ軟件計算各組0 h和24 h劃痕面積，計算劃痕愈合率，愈合率=(0 h劃痕面積-24 h劃痕面積)/0 h劃痕面積×100%。

1.7Westernblot檢測BRAFV600E細(xì)胞MEK/ERK通路蛋白分別收集BRAF野生型組、BRAFV600E突變型組對數(shù)生長期細(xì)胞，RIPA裂解，蛋白定量后，取等量進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，孵育一抗、二抗，化學(xué)發(fā)光分析儀檢測各組BRAFV600E、MEK、p-MEK、ERK、p-ERK的蛋白變化，以β-actin為內(nèi)參。MTT確定特異性抑制BRAFV600ECT26細(xì)胞的藥物組，藥物處理48 h以同上的方法檢測BRAFV600E表達(dá)。

1.8中藥單體化合物篩選利用Discovery Studio 4.0軟件(DS)，將Targetmol中藥單體化合物數(shù)據(jù)庫中的3萬個天然產(chǎn)物與BRAFV600E蛋白對接，進(jìn)行計算機(jī)虛擬篩選，總能量越低，親和度越高，以此確定候選化合物，并將排分靠前的10個化合物分別進(jìn)行體外活性驗證，觀察其對BRAF野生型和BRAFV600E突變型細(xì)胞的抑制作用。將細(xì)胞分為CT26 野生型對照組、BRAFV600E組，接種對數(shù)生長期細(xì)胞于96孔板，每孔5000個細(xì)胞，12 h后加入高、中、低濃度候選化合物，繼續(xù)培養(yǎng) 48 h后，進(jìn)行MTT檢測。藥物抑制率=(1-藥物處理組OD/未加藥物對照組平均OD)×100%。

2 結(jié)果

2.1BRAFV600E對CT26細(xì)胞增殖和遷移的影響前期測序結(jié)果顯示，CT26細(xì)胞的BRAF基因為野生型(數(shù)據(jù)未給出)。BRAFV600E慢病毒感染CT26細(xì)胞，并經(jīng)嘌呤霉素1周篩選，獲得BRAFV600ECT26穩(wěn)轉(zhuǎn)株。Fig 1的MTT檢測結(jié)果顯示，在d 2、3，細(xì)胞處于對數(shù)生長期，BRAFV600ECT26細(xì)胞相比野生型CT26細(xì)胞增殖速度更快，差異具有顯著性(P<0.05)。Fig 2的劃痕實驗結(jié)果表明，BRAFV600ECT26組24 h后劃痕愈合能力明顯強(qiáng)于野生型CT26組，量化愈合率有顯著差異。以上結(jié)果說明，BRAFV600E能夠促進(jìn)CT26細(xì)胞增殖和遷移。

2.2BRAFV600E對CT26細(xì)胞MEK/ERK通路的影響Fig 3的Western blot結(jié)果顯示，BRAFV600ECT26組高表達(dá)BRAFV600E蛋白，而野生型CT26組則無表達(dá)；與野生型CT26組相比，BRAFV600ECT26組p-MEK蛋白表達(dá)上調(diào)，但總MEK和ERK蛋白表達(dá)差異無顯著性。

Fig 1 Effect of BRAFV600E on CT26 cell n=6)

*P<0.05vswild group

Fig 2 Effect of BRAFV600E on CT26 cell migration n=3)

A: The result of wound healing(×50); B: Quantization of wound healing rate.*P<0.05vswild group.

2.3特異性抑制BRAFV600ECT26細(xì)胞中藥單體化合物篩選如Tab 1所示，DS初篩得到18種與BRAFV600E具有高親和性的候選中藥單體化合物。采用MTT法，分別檢測18種化合物對BRAFV600ECT26組和野生型CT26組細(xì)胞增殖的抑制效果。Fig 4結(jié)果顯示，給藥48 h后，低、中劑量蘆薈素、安格洛苷C和杯莧甾酮對BRAFV600E組細(xì)胞增殖抑制效果優(yōu)于對照組，差異具有顯著性(P<0.05)；但在高劑量給藥濃度下，兩組間差異無顯著性。寶藿苷I(baohuoside I)、地奧司明(diosmin)和朝霍定C(epimedin C)對兩組細(xì)胞增殖均有抑制效果，并隨藥物濃度升高，抑制率逐漸增加，但兩組細(xì)胞的抑制率差異無顯著性。其他藥物對兩組細(xì)胞均無明顯抑制效果(數(shù)據(jù)未給出)。同時，Western blot結(jié)果顯示(Fig 4)，藥物作用48 h后，隨著蘆薈素、安格洛苷C和杯莧甾酮濃度的增加，細(xì)胞中BRAFV600E蛋白表達(dá)逐漸降低。

Fig 3 Effect of BRAFV600E on MEK/ERK pathway in CT26 cells

Tab 1 High BRAFV600E affinity monomers screened by DS

VDW: Van der Waals force; Hbond: Hydrogen bonds; Elec: Electric charge.

Fig4InhibitoryeffectofcompoundsfromtraditionalChinesemedicineonBRAFV600ECT26cells

3 討論

BRAFV600E突變型結(jié)腸癌常見于近端結(jié)腸，分化較差，且與微衛(wèi)星不穩(wěn)定性(Microsatellite Instability，MSI)相關(guān)，原發(fā)腫瘤體積較大，化療的緩解率和臨床獲益都較低[7]。研究表明，BRAFV600E突變能夠持續(xù)激活MEK/ERK通路，并使癌細(xì)胞具有較高的增殖和遷移能力。此外，相對于黑色素瘤細(xì)胞，結(jié)腸癌細(xì)胞中表皮生長因子受體(Epidermal Growth Factor Receptor，EGFR)活化水平更高；接受BRAF抑制劑處理后，可導(dǎo)致MAPK通路的再度激活，進(jìn)而使其對BRAF抑制劑產(chǎn)生耐藥[8]。因此，針對BRAFV600E突變型結(jié)腸癌，常采用聯(lián)合用藥的策略，抑制EGFR-RAS-BRAF-MEK-ERK通路的激活[9]，如采用雙藥聯(lián)用，同時抑制EGFR/BRAF或者BRAF/MEK；或三藥聯(lián)用，抑制EGFR/BRAF/MEK[10]。但是這些靶向藥物常常毒副作用較強(qiáng)，成分較高，且療效甚微[11]，因此，研發(fā)新型的抗結(jié)腸癌BRAFV600E抑制劑已成為目前國內(nèi)外研究的熱點。

中藥及天然藥物中的小分子化合物因其毒副作用小、作用廣泛等特點，是尋找治療結(jié)腸癌藥物的重要來源[12-14]。已有報道證實，某些中藥成分能調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞增殖[15]，但針對BRAFV600E突變型結(jié)腸癌的中藥單體化合物的研究，尚未見報道。本研究通過計算機(jī)虛擬篩選并結(jié)合體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)，與野生型CT26組相比，蘆薈素、安格洛苷C和杯莧甾酮對BRAFV600ECT26細(xì)胞具有明顯的抑制作用，尤其在低、中劑量給藥濃度下，對BRAFV600ECT26細(xì)胞抑制率在40%左右；且對野生型CT26細(xì)胞幾乎沒有抑制效果，提示這3種中藥單體化合物可能是結(jié)腸癌BRAFV600E的特異性抑制劑；而寶藿苷I、地奧司明和朝霍定C對野生型和突變型CT26細(xì)胞均有抑制作用，且兩組間抑制率差異無顯著性，提示其存在著其他機(jī)制發(fā)揮抑癌作用。同時，Western blot結(jié)果也顯示，藥物作用48 h后，隨著蘆薈素、安格洛苷C和杯莧甾酮濃度的增加，細(xì)胞中BRAFV600E蛋白表達(dá)逐漸降低，進(jìn)一步證明了3種化合物對BRAFV600E突變型CT26結(jié)腸癌細(xì)胞具有特異性抑制效果，但其藥效機(jī)制及成藥性仍需進(jìn)一步通過體內(nèi)、外實驗證明。