張家化，羅 映，楊 洋，李雨珂，夏 慧，陳志昊，譚曉丹，彭 哲，李苗苗，楊俊卿

(重慶醫(yī)科大學藥學院藥理學教研室，重慶 400016)

近年來，大量證據(jù)支持“胎兒編程”學說，即母親孕期宮內感染、營養(yǎng)缺乏及激素水平改變等異常因素，均會干擾胎兒編程過程，嚴重時會導致胎兒發(fā)育的異常、缺陷或成為其出生后潛在致病因素[1-2]。例如，在孕期給予大鼠脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射建立孕期炎癥模型中,子代腎組織DNA甲基化水平增加，伴腎損傷及腎素血管緊張素系統(tǒng)(renin angiotensin system，RAS)激活，從而誘發(fā)高血壓[3-4]。證據(jù)顯示，先天免疫系統(tǒng)在胎兒大腦發(fā)育中非常重要，孕婦感染可導致胎兒腦白質細胞死亡和髓鞘形成缺陷[5-6]。胎盤炎癥與早產(chǎn)兒腦損傷密切相關，且胎盤炎癥程度越重，早產(chǎn)兒腦損傷發(fā)生風險越高[7]。但是，相關的動物實驗研究的直接證據(jù)較少，最新研究表明，SD大鼠孕期LPS刺激，可導致胎鼠腦水腫和凋亡，以及新生14 d子鼠室周區(qū)脫髓鞘和白質損傷[8]。而孕期炎癥子代大鼠皮層及海馬神經(jīng)元是否發(fā)生改變、行為功能是否異常，少見報道。另一方面，孕期炎癥對子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)影響的機制至今尚不清楚，需要深入研究。

大量研究證明，神經(jīng)系統(tǒng)疾病由缺血、缺氧、鈣超載、興奮性氨基酸、氧化應激、炎癥因子等多種因素引起[9]。炎癥因子引起神經(jīng)元損傷、凋亡的觀點已被學者廣泛認可。多項流行病學研究顯示，以環(huán)氧化酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)為經(jīng)典作用靶點的非甾體抗炎藥，能夠明顯降低老年人發(fā)生神經(jīng)系統(tǒng)疾病的危險性[10]。新近動物實驗研究表明，COX-2下游產(chǎn)物前列腺素E2(prostaglandin E2，PGE2)能通過受體調節(jié)小膠質細胞活化，調節(jié)大腦的炎癥反應程度，對神經(jīng)元功能和存活起決定性作用，提示COX-2途徑有可能作為神經(jīng)系統(tǒng)疾病干預的潛在新靶點[11]。因此，本實驗建立孕期炎癥模型，觀察孕期LPS刺激對子代大鼠行為學、皮層及海馬形態(tài)的影響，并從COX-2及其下游通路初步探討其機制。

1 材料與方法

1.1實驗動物SPF級SD♀鼠，6～8周齡，體質量220～250 g，由重慶醫(yī)科大學動物實驗中心提供，動物生產(chǎn)許可證編號：SCXK(渝2012-0001)。子代SD大鼠，由孕鼠繁殖。

1.2試劑LPS購自美國Sigma公司；前列腺素D2(prostglandin D2，PGD2)、PGE2、前列腺素I2(prostglandin I2，PGI2)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)、白介素6(interleukin-6，IL-6)和白介素1β(interleukin-1β，IL-1β) ELISA試劑盒，均購自上海源葉公司；COX-2抗體，購自英國Abcam公司；羊抗兔HRP標記二抗，購自武漢三鷹。

1.3儀器Morris水迷宮系統(tǒng)(北京眾實迪創(chuàng)科技發(fā)展有限責任公司)；YLS-1B型多功能大鼠自發(fā)活動記錄儀(山東省醫(yī)學科學院設備站)；BH-2光學顯微鏡(Olympus公司)；全自動酶標儀(Spectra MaxM2公司)。

1.4方法

1.4.1動物分組及實驗設計 8只孕鼠隨機分為生理鹽水(normal saline，NS)[8]組和LPS組，每組4只。LPS組孕鼠在孕期d 11、14、18腹腔注射LPS，每次300 μg·kg-1；NS組孕鼠腹腔注射同容積的生理鹽水。一日3次觀察孕鼠情況，至其生產(chǎn)。出生的子鼠中，每組隨機選取30只新生子鼠并編號，分別記錄它們出生d 3、10、20、30的體質量，在d 30時每組隨機選取9只♂鼠進行行為學測試之后，其中每組3只進行腦組織病理學檢查，每組6只進行ELISA檢測和Western blot實驗。

1.4.2Morris水迷宮測試 子鼠出生后d 30，采用Morris水迷宮測定大鼠空間學習記憶能力，實驗前讓子代♂大鼠熟悉環(huán)境15 min。整個測試程序分為2個階段：(1)定向航行階段：將大鼠頭朝向水迷宮的池壁放入水中。記錄大鼠第1次登上平臺的時間。大鼠連續(xù)訓練4 d，每天每只大鼠訓練4次，每次訓練間隔15～20 min。(2)空間記憶檢測階段：d 5進行測試，將大鼠從最后一次訓練的位置放入水中，將平臺撤除，記錄大鼠穿越平臺次數(shù)，并記錄大鼠運動軌跡。

1.4.3曠場實驗 實驗于周圍環(huán)境安靜、可見度為5 m的暗室中進行，實驗裝置為內部黑漆覆蓋，長、寬、高為100 cm×100 cm×50 cm的木箱，底面均分為25個方格(每個20 cm×20 cm)，子代大鼠被放置于中央方格，記錄其5 min內活動情況。①垂直運動(rearing)：兩前爪騰空或攀附墻壁的活動記錄得分。②水平運動(horizontal movement)：穿行的方格數(shù)記錄得分，穿行方格的定義為，大鼠4只腳都進入同一格子中。③理毛次數(shù)(grooming)：每只大鼠前爪整理毛發(fā)的次數(shù)。④排泄次數(shù)(excretion)：每只大鼠排泄的次數(shù)。

1.4.4自主活動測試 將各組的子代大鼠放入多功能大鼠自主活動記錄儀中,記錄時室內保持安靜，適應實驗環(huán)境5 min后,測定大鼠各組自主活動次數(shù),記錄時間為5 min。

1.4.5腦組織病理學檢查 進行Morris水迷宮測試之后，d 2每組隨機選取3只大鼠稱體質量，1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，暴露胸腔，先注入PBS沖洗，然后用注入4%多聚甲醛在體灌流固定。將腦組織放入4%多聚甲醛4 ℃固定2 d。取出腦組織，石蠟包埋后進行冠狀切片，厚度約5 μm。對石蠟切片進行HE染色。顯微鏡光鏡下觀察子代大鼠海馬和皮層神經(jīng)元的形態(tài)結構變化，并進行死亡神經(jīng)細胞計數(shù)的定量分析。

1.4.6ELISA法測定大鼠海馬和皮層中PGD2、PGE2、PGI2、TNF-α、IL-6和IL-1β的含量 除進行腦組織病理學檢查的大鼠外，每組剩下6只大鼠全部用1%戊巴比妥鈉(50 mg·kg-1)腹腔注射麻醉后，斷頭取腦，冰面分離皮層和海馬，-80 ℃保存。取-80 ℃保存的海馬和皮層組織(每組6只)，稱重后，按照重量體積比(W/V)1 ∶9，加入生理鹽水，于冰面進行勻漿，制備組織勻漿液，4 ℃、3 000×g離心30 min，收集上清液。從冰箱取出用于分離游離型和結合型酶標記物的濃縮洗滌液[10]，水浴加熱時結晶溶解，用蒸餾水按1 ∶20稀釋，配制成所需濃度的稀釋洗滌液。取出檢測所需微孔板，室溫條件下平衡20 min。根據(jù)ELISA試劑盒說明書操作，所用試劑均在臨用前新鮮配制，設置標準孔及樣品孔，參照ELISA測試盒說明書操作。在反應終止后15 min內，采用酶標儀在450 nm波長處測試各孔OD值，并根據(jù)標準曲線計算樣品濃度。

1.4.7Western blot測定大鼠海馬和皮層中COX-2蛋白表達 取-80 ℃保存的海馬、皮層組織，提取各組總蛋白。SDS-PAGE電泳、轉膜，5%胎牛血清封閉4 h。加入相應的一抗COX-2、β-actin(1 ∶1 000)，4 ℃孵育過夜?；厥找豢梗琓BST洗膜，5 min×4次，滴加HRP標記的二抗(1 ∶2 000)，于搖床上室溫孵育2 h。TBST洗膜，5 min×4次，然后用成像分析系統(tǒng)成像并檢測。每組實驗重復3次。

2 結果

2.1孕期炎癥子代大鼠體質量監(jiān)測如Fig 1所示，體質量監(jiān)測從子鼠出生后3 d起至30 d,兩組子鼠體質量均隨著天數(shù)的延長而增加,相比于NS組，LPS組差異無統(tǒng)計學意義。

2.2孕期炎癥子代大鼠神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育情況Morris水迷宮實驗結果顯示，LPS組子代大鼠d 5逃避潛伏期明顯長于NS組(P<0.05)。與NS組相比，d 5 LPS組子代大鼠穿越平臺次數(shù)明顯減少(P<0.05)。與NS組比較，LPS組子代大鼠運動軌跡明顯延長。曠場實驗主要測試動物在新異環(huán)境中的自主行為和對新環(huán)境的探索力。與NS組相比，LPS組的水平運動明顯減少(P<0.05)，而垂直運動、理毛次數(shù)和排泄次數(shù)差異無顯著性。自主活動測試的結果顯示，與NS組相比，LPS組的自發(fā)活動明顯減少(P<0.05)。見Fig 2。

2.3孕期炎癥子代大鼠腦組織病理學變化在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，海馬是與學習、記憶功能密切相關的重要腦區(qū)，也是應激反應和神經(jīng)損傷的主要部位。如Fig 3所示，NS組子代大鼠海馬區(qū)神經(jīng)細胞層次清晰，結構完整，排列整齊，未見明顯核固縮；LPS組子代大鼠海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細胞丟失和(或)核固縮多于NS組(P<0.05)。與海馬特點相似，孕期LPS炎癥組大鼠皮層神經(jīng)元細胞核明顯深染、固縮(P<0.01)。

2.4孕期炎癥子代大鼠海馬和皮層炎性因子含量在中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)展過程中，COX-2蛋白表達變化與神經(jīng)系統(tǒng)病變密切相關，而前列腺素(prostaglandins，PGs)，如PGD2、PGE2、PGI2是由COX-2催化花生四烯酸(arachidonic acid，AA)代謝產(chǎn)生。如Fig 4所示，相比于NS組，LPS組大鼠海馬和皮層中PGE2、PGD2和PGI2明顯升高(P<0.01，P<0.05)。TNF-α、IL-6和IL-1β是常見的促炎細胞因子，通常在炎癥發(fā)生部位存在高濃度的聚集。如Fig 4所示，與NS組相比，LPS組大鼠海馬和皮層中的TNF-α、IL-6和IL-1β在子代大鼠海馬中的含量明顯升高(P<0.01,P<0.05)。

Fig 2 Behavioral changes in offspring rats exposed to LPS during

A:Comparison of the mean escape latencies to find the hidden platform on days 1-5; B:Comparison of the mean in the number of crosses in the MWM on days 5; C:Comparison of each group to find the trajectory of the hidden platform; D:Open field behavior of postnatal day (P)30 rats over 5 min that received LPS or saline on pregnancy(1: Rearing; 2: Horizontal movemet; 3: Grooming; 4: Excretion); E:Spontaneous locomotor activity of P30 rats over 5 min that received LPS or saline on pregnancy.*P<0.05vsNS group.

2.5孕期炎癥子代大鼠海馬和皮層COX-2的蛋白表達Fig 5的Western blot結果顯示，與NS組相比，LPS組大鼠海馬及皮層COX-2蛋白表達均明顯升高(P<0.01)。

3 討論

神經(jīng)系統(tǒng)是機體最復雜的系統(tǒng)之一，是胚胎發(fā)育過程中不可或缺的一個環(huán)節(jié)。研究表明，許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生與妊娠期胎兒在子宮內生長的環(huán)境密切相關[1]。流行病學研究提示，產(chǎn)前感染會增加神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病率[8]，原因可能是感染引起母體宿主中促炎細胞因子的升高，導致胚胎中的一些炎癥因子如TNF-α和IL-1β水平發(fā)生改變。另外，孕期感染可引起子代大鼠腦中活化的小膠質細胞和星形膠質細胞增多，激活的膠質細胞產(chǎn)生許多炎性因子，可導致氧化應激反應增強[12]。

Fig 3 Effect of inflammation during pregnancy on hippocampus and cortex in offspring rats(HE×400)

細胞膜磷脂在磷脂酶A2的作用下生成AA，AA在COX-2作用下生成大量PGs，如PGD2、PGE2、PGI2，介導炎癥的發(fā)生。炎癥在許多神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機制中起著關鍵性的作用。研究表明，COX-2在正常腦組織中含量低，但在炎癥狀態(tài)的腦組織中占有重要地位[13]。COX-2在一些腦疾病中均有高表達，如全腦缺血[14]和阿爾茨海默病(Alzheimer’s dis-ease， AD)[15]等。目前，并無相關研究證實COX-2表達與孕期炎癥致子代腦損傷的發(fā)病機制相關。

Fig 4 Changes of PGD2, PGE2, PGI2, TNF-α, IL-6 and IL-1β contents in rat hippocampus(A) and

*P<0.05,**P<0.01vsNS group

**P<0.01vsNS group

本研究觀察孕期子代大鼠出生后，空間學習記憶、曠場實驗、自主活動、腦組織病理學、COX-2及下游PGs的表達、炎性因子水平等指標的改變。結果顯示，孕期炎癥子代大鼠學習記憶功能明顯受損；水平運動和自發(fā)活動次數(shù)明顯減少；海馬和皮層的神經(jīng)細胞核深染、固縮明顯；COX-2蛋白表達明顯增加；COX-2催化產(chǎn)物前列腺素PGD2、PGI2和PGE2,以及炎性細胞因子TNF-α、IL-6和IL-1β含量明顯增加。提示母體孕期炎癥暴露，炎性細胞因子如TNF-α、IL-6和IL-1β可能會通過胎盤屏障、血腦屏障，導致子代大鼠處于炎癥狀態(tài)，進而引起COX-2激活；激活的COX-2誘導AA生成大量PGs，如PGD2、PGE2和PGI2，這些PGs持續(xù)升高，引起誘導型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iONS)釋放大量具有神經(jīng)毒性的自由基，如一氧化氮(nitric oxide，NO)，最終導致孕期炎癥子代大鼠腦損傷的發(fā)生。因此，COX-2及下游PGs與孕期炎癥子代腦損傷的發(fā)生、發(fā)展密切相關。但是，具體的分子機制及因果關系需要采用進一步實驗研究加以明確。

綜上所述，孕期炎癥刺激可導致子代大鼠行為學異常、皮層及海馬神經(jīng)元損傷，其機制可能與COX-2及下游PGs產(chǎn)生有關。