汪陶榮，張 曄，曹 威，張俊強，殷曈昕，朱皓晨，蘇逸明，陳思嫻，瞿子庭，王高遠，張麗霞，陳曉宇，2

(安徽醫(yī)科大學1. 組織胚胎學教研室、2. 形態(tài)學實驗中心、3. 臨床醫(yī)學院、4. 藥學院，安徽 合肥 230032；5. 第一附屬醫(yī)院骨科，安徽 合肥 230022)

類風濕性關節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)屬于自身免疫性疾病，病情反復發(fā)作，導致關節(jié)損傷，甚至致殘[1]。RA的特殊病因是成纖維細胞樣滑膜細胞(fibroblast-like synoviocytes, FLSs)異常增殖，F(xiàn)LSs在關節(jié)損傷中起關鍵作用[2]。RA的發(fā)病與氧自由基生成有關[3]，活性氧(reactive oxygen species, ROS)在生理狀態(tài)下主要是由線粒體生成，即線粒體活性氧(mitochondrial reactive oxygen species, mtROS)，研究表明，mtROS與RA等疾病的病理生理學有關[4]。白藜蘆醇(resveratrol,Res)是一種天然的多酚類化合物，它廣泛存在于葡萄、虎杖等植物中[5]。低濃度的Res能降低mtROS，減少ROS引起的脂質過氧化和DNA損傷，高濃度Res可引起細胞凋亡[6]。Res可活化線粒體去乙?；易宓娜ヒ阴；?(sirtuin 3, SIRT3)，SIRT3通過調節(jié)錳超氧化物歧化酶(manganese superoxide dismutase, MnSOD)的去乙?；饔?，調節(jié)mtROS平衡和能量代謝[7]。該文主要研究Res通過MnSOD-mtROS途徑影響RA的FLSs增殖和凋亡，為RA的治療提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞與試劑 RA-FLSs細胞系(編號C0495)，購自上海冠導生物有限公司。Res(批號R5010,分子量228.24)，購自美國Sigma公司；DMEM(10569-010)，購自美國Gibco公司；胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)(04-001-1ACS)，購自美國BI公司；兔抗人MnSOD(ab13533)、GAPDH(ab9485)，購自美國Abcam公司；Annexin V-PE/7-AAD細胞凋亡檢測試劑盒(BB-41012-3)，購自上海貝博生物公司；CCK-8試劑盒(C0037)，購自碧云天生物有限公司；Mito SOX紅色探針(40778ES50)，購自上海翊圣生物科技有限公司。

1.1.2儀器 MultikanFC型酶標儀(美國賽默飛世爾公司)；激光八色流式細胞儀(美國BD公司)；Thermo Forma4111CO2恒溫培養(yǎng)箱(美國熱電公司)；LEICA.SP5-DMI6000-DIC共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)；蛋白電泳儀、蛋白轉膜儀、凝膠成像系統(tǒng)(北京六一儀器廠)；TS2R-FL熒光倒置顯微鏡(日本尼康公司)。

1.2方法

1.2.1細胞培養(yǎng) RA-FLSs用含10% FBS和1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)于37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中。待細胞長到80%左右密度時，用5 μmol·L-1H2O2處理12 h后，再用Res處理24 h。

1.2.2慢病毒感染細胞 預實驗確定復感染指數(shù)(multiplicity of infection，MOI)為50。用完全培養(yǎng)基制備密度為3×107·L-1的細胞懸液，種到6孔板中，每孔2 mL。培養(yǎng)24 h，加入50 μL 1×108TU病毒、40 μL 25×HitransG慢病毒感染試劑、910 μL完全培養(yǎng)基。感染12 h后，應用常規(guī)培養(yǎng)基。感染48 h后，加入嘌呤霉素篩選，通過殺死曲線確定濃度為8 mg·L-1。感染72 h后，熒光倒置顯微鏡觀察感染效果。

1.2.3mtROS水平測定 mtROS水平檢測應用Mito SOX Red探針。在50 μg Mito SOX Red中加入13 μL DMSO，混勻配制成5 mmol·L-1的Mito SOX Red工作液。取對數(shù)生長期細胞，按照2×105/孔細胞接種于激光共聚焦培養(yǎng)皿中，待細胞生長密度至80%左右時，H2O2作用12 h后, Res作用24 h，PBS洗滌2次，加入用無血清培養(yǎng)液稀釋的Mito SOX Red工作液，終濃度為5 μmol·L-1的探針工作液2 mL，37 ℃細胞培養(yǎng)箱內避光孵育15 min，用無血清細胞培養(yǎng)液洗滌細胞3次，立即行激光共聚焦掃描顯微鏡觀察攝片。

1.2.4CCK-8法檢測細胞增殖 將對數(shù)生長期的RA-FLSs接種于96孔板中，每孔加入100 μL(2 000個細胞)，設置3個復孔，次日細胞貼壁后，5 μmol·L-1H2O2預處理細胞12 h，Res處理24 h后,細胞培養(yǎng)液作為對照組。每孔加入10 μL CCK-8工作液，繼續(xù)培養(yǎng)4 h。酶標儀在450 nm處測定吸光度A值。

1.2.5流式細胞儀檢測細胞凋亡 采用流式細胞儀結合AnnexinV-PE/AAD試劑盒雙標記染色，測定細胞凋亡率。取對數(shù)生長期細胞，按照2×105/孔細胞接種于6孔板，依照上述H2O2濃度和Res濃度分組，胰酶消化收集細胞。按照試劑盒說明操作：冷PBS洗滌細胞2次，用400 μL Annexin V結合液，調整密度約1×109·L-1，加入5 μL AnnexinV-PE染色液，輕輕混勻，(2～8) ℃避光孵育15 min，然后加入10 μL AAD染色液，輕輕混勻，(2～8) ℃避光孵育5 min，行流式細胞儀分析。

Fig 1 Effects of resveratrol on RA-FLSs

*P<0.05vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group

Fig 2 Effect of resveratrol on expression

**P<0.01vscontrol group;##P<0.01vsH2O2group

1.2.6免疫印跡分析 取對數(shù)生長期細胞, 按照2×105/孔細胞接種于6孔板，待細胞生長密度至80%左右時。同上加藥處理后，將6孔板置于冰上，每孔加入增強型RIPA裂解液(含1 mmol·L-1蛋白酶抑制劑、PMSF)150 μL作用1 min，提取總蛋白，4 ℃、12 000 r·min-1離心15 min，取上清液，BCA蛋白試劑盒蛋白定量后，再進行SDS-PAGE電泳，轉膜，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，4 ℃孵育MnSOD(1 ∶5 000)、GAPDH(1 ∶2 500)抗體；過夜后，TBST洗膜3次，每次10 min，二抗室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，每次10 min，ECL化學發(fā)光曝光3～5 min，顯影。

2 結果

2.1Res抑制RA-FLSs增殖不同濃度的Res作用于RA-FLSs，CCK-8法檢測其增殖情況，5 μmol·L-1H2O2刺激FLSs模擬體外氧化應激環(huán)境。如Fig 1所示，5 μmol·L-1H2O2細胞活力明顯高于對照組(t=3.385，P=0.0277)，然后加入不同濃度的Res，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的增加，RA-FLSs的細胞活力降低越來越明顯(F=16.99，P=0.008)。

2.2Res降低RA-FLSs內MnSOD的表達如Fig 2所示，與對照組比較，5 μmol·L-1H2O2組MnSOD蛋白表達升高(t=4.750,P=0.009)，給予不同濃度的Res處理之后,MnSOD蛋白表達逐漸降低，并且呈現(xiàn)濃度依賴性(F=17.54，P=0.0007)。

2.3慢病毒載體成功感染了RA-FLSs用MnSOD過表達和MnSOD干擾慢病毒載體同時感染RA-FLSs，72 h后用熒光倒置顯微鏡觀察慢病毒載體攜帶的綠色熒光標記，發(fā)現(xiàn)感染效率均在60%以上。因為載體攜帶嘌呤霉素抗性基因，用8 mg·L-1(濃度由死亡曲線確定)的嘌呤霉素進行篩選后，感染效率達到90%(Fig 3)。為了檢測MnSOD過表達慢病毒和MnSOD干擾慢病毒是否增加或降低RA-FLSs中MnSOD蛋白表達，Western blot檢測結果顯示，與對照組相比，MnSOD干擾慢病毒感染的RA-FLSs中MnSOD的蛋白水平表達下調(t=4.651，P=0.0097)，MnSOD過表達病毒感染的RA-FLSs中MnSOD的蛋白表達水平均上調(t=4.242，P=0.0132)。證實慢病毒成功感染了目的細胞，并上調或下調了MnSOD的表達。

2.4MnSOD調節(jié)mtROS水平H2O2處理對照組、MnSOD過表達慢病毒感染組、MnSOD干擾慢病毒感染組的RA-FLSs用相關因素處理12 h后，再用200 μmol·L-1的Res分別孵育24 h，MitoSOX紅色探針檢測各組細胞mtROS水平。Fig 4結果表明，與模型組相比，在相同濃度Res處理下，MnSOD過表達組mtROS的水平降低(t=5.117，P=0.0069)，而MnSOD干擾組結果相反(t=4.852，P=0.0083)。

Fig 3 RA-FLSs infected by lentiviral vector

Fig4mtROSlevelsmediatedbyMnSODregulation(×400) A:Control group; B: Model group; C: Model+200 μmol·L-1Res group; D: MnSOD overexpression+200 μmol·L-1Res group; E: MnSOD interference+200 μmol·L-1Res group.**P<0.01vsmodel group;##P<0.01vsmodel+200 μmol·L-1Res group.

2.5MnSOD抑制RA-FLSs凋亡采用AnnexinV-PE/AAD試劑盒，流式細胞儀檢測Res對5 μmol·L-1H2O2處理的不同組RA-FLSs凋亡的影響。如Fig 5所示，Res促進RA-FLSs凋亡，而MnSOD過表達組則在同種濃度的Res處理下，凋亡率減少(t=4.691，P=0.0094)；MnSOD干擾組凋亡率增加(t=4.100，P=0.0149)。

3 討論

本課題組前期實驗發(fā)現(xiàn)[7]，Res可以抑制RA-FLSs增殖，采用5 μmol·L-1H2O2刺激FLSs模擬體外氧化應激環(huán)境，在加入不同濃度的Res后，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度的增加，F(xiàn)LSs的細胞活力明顯降低。采用流式細胞技術檢測Res對RA-FLSs凋亡的影響，發(fā)現(xiàn)隨著Res濃度增加，F(xiàn)LSs的凋亡逐漸增高。同時，線粒體超氧化物檢測試劑盒結果顯示，加入不同濃度的Res之后，RA-FLSs中mtROS的紅色熒光逐漸增強，且具有統(tǒng)計學意義。結合上述mtROS在Res處理的RA-FLSs含量和凋亡數(shù)據(jù)，提示Res很可能通過改變RA-FLSs的mtROS含量，產(chǎn)生過多的mtROS，導致異常增殖RA-FLSs的凋亡。前期實驗結果表明[7]，Res降低線粒體氧化應激相關蛋白SIRT3和MnSOD的表達，Res處理后，SIRT3和MnSOD蛋白表達呈現(xiàn)劑量依賴性降低。結合Res增高mtROS水平的結果，提示Res可能通過作用于線粒體中的SIRT3和MnSOD蛋白，升高mtROS水平，最終引起細胞凋亡。為了驗證Res是否可以通過SIRT3-MnSOD信號途徑調節(jié)mtROS水平，促進H2O2處理的RA-FLSs凋亡，本研究構建MnSOD過表達和干擾的慢病毒載體，使RA-FLSs的MnSOD表達活化和抑制，結果證實，Res可以通過SIRT3-MnSOD信號途徑調節(jié)mtROS水平。

RA患者的FLSs失去控制的增長和死亡失衡是RA的特殊病征，促進RA的FLSs凋亡將是RA治療的主要干預措施[8-9]。線粒體凋亡途徑是主要的凋亡途徑，在線粒體凋亡途徑中，線粒體主要是增加了ROS的生成[10]。本研究結果證明，活化或抑制MnSOD表達后，200 μmol·L-1Res處理RA-FLSs后，ROS發(fā)生明顯變化，從而對凋亡產(chǎn)生影響。在此實驗中，我們猜想Res介導mtROS生成增多可能是RA-FLSs的特殊特征。

綜上，本研究證實Res可能通過MnSOD-mtROS信號通路，抑制RA-FLSs增殖。圍繞mtROS,明確mtROS在H2O2誘導的FLSs增殖中作用，通過體外實驗探明Res對FLSs增殖的影響，探明MnSOD-mtROS信號途徑在Res抑制RA-FLSs增殖中的作用及機制，為RA的形成機制和藥物設計提供新靶點，是針對RA的一種潛在的治療方法。

(致謝：本實驗主要在安徽醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院形態(tài)實驗中心、組胚實驗室完成，在此對實驗室各位老師及同學的幫助致以衷心的感謝！)