石典花， 宗珊珊， 胡 軍， 戴衍朋， 張 軍， 孫立立?， 張學(xué)蘭?

（1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東濟(jì)南250355；2.山東省中醫(yī)藥研究院，山東 濟(jì)南250014；3.山東省中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，山東濟(jì)南250014）

側(cè)柏葉為柏科植物側(cè)柏 Platycladus orientalis（L.）Franco的枝梢及葉，大多在夏、秋二季采集，其味苦、澀，性寒，具有涼血止血、化痰止咳、生發(fā)烏發(fā)之功效，主要用于吐血、衄血、咯血、便血、崩漏下血、肺熱咳嗽、血熱脫發(fā)、須發(fā)早白［1］，全國大部分地區(qū)均有生產(chǎn)［2］。它主要含有揮發(fā)油［3-4］、 黃酮［5-6］、 鞣質(zhì)［7-8］等多種成分， 具有止血［9-10］、 抗 炎［11］、 抗菌［12］、 抗 氧化［13-14］、 抗 腫瘤［15］、防脫發(fā)［16］等作用。

目前，中藥理化鑒別方法主要包括熒光法、微量升華法、顯色、沉淀、泡沫反應(yīng)、鈣鹽、鈉鹽、TLC法等，其中TLC法處理簡單，成本低，可同時對多個成分進(jìn)行比較，不需使用復(fù)雜儀器，應(yīng)用范圍最廣泛。側(cè)柏葉中主要有效成分為槲皮苷等，但由于其分子量較大而難以分離，其TLC鑒別一直是方法學(xué)研究的難點(diǎn)，故2015年版 《中國藥典》中將其酸水解生成苷元槲皮素后再進(jìn)行鑒別，但該方法涉及索氏提取步驟，至少需6 h，而加熱回流需1 h，因此存在操作繁瑣、耗時長、有機(jī)試劑用量多、成本高等缺點(diǎn)，無法滿足實(shí)際應(yīng)用中高效、簡便的需求，而且目前尚無直接以槲皮苷為對照品的側(cè)柏葉TLC鑒別方法。因此，本實(shí)驗(yàn)一方面對藥典提取條件進(jìn)行改進(jìn)，使得鑒別時間大大縮短；另一方面直接以槲皮苷為對照品進(jìn)行鑒定，以期達(dá)到直接用于側(cè)柏葉TLC鑒別方法的目的。

1 材料

1.1 儀器 WFH-201B型紫外儀 （上海精科實(shí)業(yè)有限公司）；XMT804型電熱恒溫水浴鍋 （上海醫(yī)療器械五廠）；DHG-9146型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 （上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）；LC-350A型超聲波中藥處理機(jī) （濟(jì)寧市中區(qū)魯超儀器廠）；圓底燒瓶、具塞錐形瓶、漏斗、分液漏斗等。

1.2 試藥 側(cè)柏葉采自濟(jì)南燕子山、南部山區(qū)、千佛山、臨沂費(fèi)縣，經(jīng)專家鑒定為正品，自然陰干。槲皮素對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號00819304）；槲皮苷對照品 （成都普瑞法科技開發(fā)有限公司，批號16022001）；硅膠G薄層板 （自制）。甲醇、乙酸乙酯、鹽酸、甲苯、甲酸、乙醇等均為分析純；水為蒸餾水。

2 方法與結(jié)果

2.1 原藥典法 取藥材粉末3 g，置索氏提取器中，加適量乙醚加熱回流至提取液無色，棄去乙醚液，藥渣揮干乙醚，加70%乙醇50 mL，加熱回流1 h，趁熱濾過，濾液蒸干，殘?jiān)?25 mL水溶解，加 3 mL鹽酸，加熱水解30 min，立即冷卻，用乙酸乙酯振搖提取 2次，每次20 mL，合并乙酸乙酯液，用水洗滌3次，每次10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取槲皮素對照品適量，加乙醇制成每1 mL含0.1 mg該成分的溶液，作為對照品溶液。按照2015年版 《中國藥典》四部通則0502，吸取供試品、對照品溶液各3 μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 （5∶2∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外光燈 （365 nm）下檢視，結(jié)果見圖1。由圖1可知，供試品色譜在對照品相應(yīng)位置上顯相同顏色熒光斑點(diǎn)，而且其清晰、分離度良好。

圖1 側(cè)柏葉TLC色譜圖 （原藥典法）

圖2 側(cè)柏葉TLC色譜圖 ［改進(jìn)藥典法 （以槲皮素為對照品）］

2.2 改進(jìn)藥典法 （以槲皮素為對照品） 針對原藥典法中提取耗時長、步驟繁瑣的問題，本實(shí)驗(yàn)建立省去索氏提取而直接回流水解的方法。取藥材粉末3 g，置錐形瓶中，加水25 mL、鹽酸3 mL，水浴加熱回流30 min，趁熱濾過，濾液置分液漏斗中，加25 mL乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯層水洗3次，每次10 mL，水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取槲皮素對照品適量，加乙醇制成0.1 mg／mL溶液，作為對照品溶液。按照2015年版 《中國藥典》四部通則0502，吸取供試品、對照品溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸 （5∶2∶1）上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈 （365 nm）下檢視，結(jié)果見圖2。由圖2可知，各批藥材在槲皮素對照品相應(yīng)位置上均顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。

2.3 改進(jìn)藥典法 （以槲皮苷為對照品） 原藥典法是將側(cè)柏葉中槲皮苷酸水解生成槲皮素后進(jìn)行鑒別，本實(shí)驗(yàn)建立不水解而直接鑒別側(cè)柏葉中槲皮苷的方法。取藥材粉末1 g，置具塞錐形瓶中，加20 mL 70%甲醇超聲30 min，過濾，濾液水浴蒸干，殘?jiān)? mL甲醇溶解，作為供試品溶液；取槲皮苷對照品適量，加乙醇制成0.1 mg／mL溶液，作為對照品溶液。按照2015年版 《中國藥典》四部通則0502，吸取供試品、對照品溶液各3 μL，點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以乙酸乙酯-甲酸-水 （12∶1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁-乙醇溶液，置紫外光燈 （365 nm）下檢視，結(jié)果見圖3。由圖3可知，各批藥材在槲皮苷對照品相應(yīng)位置上均顯相同顏色熒光斑點(diǎn)。

圖3 側(cè)柏葉TLC色譜圖 ［改進(jìn)藥典法 （以槲皮苷為對照品）］

3 討論

現(xiàn)行 《中國藥典》中側(cè)柏葉鑒別方法為將其葉綠素成分用索氏提取器提取后，再對其黃酮類成分槲皮苷酸水解生成槲皮素，接著用乙酸乙酯萃取、水洗、濃縮?；谏鲜鏊庠?，本實(shí)驗(yàn)建立的第1種方法是省去耗時較長的索氏提取步驟，將側(cè)柏葉水解后直接萃取，也可達(dá)到有效去除葉綠素、水解槲皮苷、富集槲皮素的目的，較原藥典法更省時省力、簡便快速。

考慮到側(cè)柏葉中含槲皮苷，不含槲皮素，本實(shí)驗(yàn)嘗試建立1種不水解而直接以槲皮苷為對照品的鑒定方法。首先，分別對甲醇加熱回流1 h、超聲1 h、超聲30 min等提取條件進(jìn)行篩選，樣品量從3 g降到1 g，最終確定為樣品量1 g，超聲提取30 min。其次，考察以乙醇-丙酮-水 （7∶5∶6）、正己烷-乙酸乙酯-甲酸 （7∶5∶0.8）、 乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1）等藥典收載的黃酮類成分展開系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1）展開效果較好。接著，比較不同比例乙酸乙酯-甲酸-水 （8∶1∶1、10∶1∶1、12∶1∶1、 14∶1∶1）， 最終確定在12∶1∶1比例下斑點(diǎn)分離度良好，顯色清晰。該方法較以槲皮素為對照品更高效快捷，而且槲皮苷是側(cè)柏葉中原有成分，不需要再酸水解生成槲皮素，直接超聲30 min即可進(jìn)行TLC鑒別，不僅可大大提高鑒別效率，還能節(jié)約藥材和試劑。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)建立了2種快速簡便的側(cè)柏葉TLC鑒別方法，1種以原藥典法為基礎(chǔ)，通過改進(jìn)提取方法達(dá)到快速鑒別的目的；另1種直接以側(cè)柏葉中原有成分槲皮苷為對照品，兩者較原藥典法均可節(jié)省80%以上時間，操作簡便，斑點(diǎn)清晰，而且均能達(dá)到高效、快速、簡便的TLC鑒別目的，其中又以后者更高效合理?；诖耍ㄗh新版 《中國藥典》修訂側(cè)柏葉TLC鑒別方法。