陳永華， 楊文明， 江海林， 唐露露

（1.安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院腦病中心，安徽合肥230031；2.安徽中醫(yī)藥大學(xué)研究生院，安徽合肥230038）

Wilson病是因遺傳性ATP7B基因突變導(dǎo)致的銅代謝障礙性疾?。?］，銅蓄積中毒是其肝細胞損害的主要原因，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡信號通路是重要肝細胞凋亡途徑［2-3］，對此通路的干預(yù)可能是患者肝損害新的治療靶點。中醫(yī)證候?qū)W調(diào)查研究顯示，銅邪毒與痰瘀血互結(jié)是Wilson病患者常見證候［4］，清熱解毒、祛瘀通腑方肝豆靈片可改善肝損害，減少銅負荷誘導(dǎo)的肝細胞凋亡［5］，但其確切作用機制尚不明確，故本實驗探討該制劑治療肝損害的分子機制。

1 材料

1.1 動物 2對Wilson病模型小鼠 （TX小鼠）及DL小鼠的種鼠均購于美國Jackson實驗室，小鼠肝細胞用原代方法進行培養(yǎng)及分離得到［6］。SD大鼠44只，體質(zhì)量 （195±15）g，購于安徽省實驗動物中心，許可證號SYXK-2017-004，適應(yīng)性飼養(yǎng)7 d后進行實驗。

1.2 試藥 肝豆靈片 （安徽省中醫(yī)院制劑中心，0.3 g／片，批號20160012），由川黃連、紫丹參、血風(fēng)藤、蜀大黃、蓬莪術(shù)、毛姜黃等組成，制備方法為用65%乙醇提取各藥材有效成分，合并濾液，合適溫度下烘制成干膏，加入煉蜜及淀粉，最后壓片包裝。硫酸銅 （國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；達爾白克必需基本培養(yǎng)基 （DMEM）購自美國Gibco公司，批號12400035；胎牛血清 （FBS）購自美國Hyclone公司，批號10099-156；HumanPERK、CHOP引物［寶生物工程 （大連）有限公司］；Salubrinal（特異性eIF2a磷酸化抑制劑，美國西格瑪公司）。

1.3 儀器 二氧化碳培養(yǎng)箱 （上海基匯生物科技有限公司）；高性能超凈工作臺 （廣東坤靈凈化設(shè)備有限公司）；BG-Power300基本電泳儀電源 （北京百晶生物技術(shù)有限公司）；Gstorm梯度多重控溫梯度PCR儀 （武漢成名儀器有限公司）；Amnis高速成像流式細胞儀 ［德國默克密理博（中國）有限公司］；分光光度計 ［北京北分瑞利分析儀器（集團）有限責任公司］。

2 方法

2.1 藥物血清、硫酸銅培養(yǎng)基制備 SD大鼠隨機分為空白組及肝豆靈片低、中、高劑量組，每組11只。參照韓輝等［7］報道方法，將肝豆靈片溶于5 mL滅菌用水中，配制成0.06、0.12、0.24 g／mL溶液，根據(jù)成人常規(guī)用藥量標準換算成大鼠用藥量 （1.20 g／kg），設(shè)置肝豆靈片低、中、高劑量組分別為0.60、1.20、2.40 g／kg，每天早晚2次灌胃給藥，連續(xù)4 d。第4天給藥結(jié)束后抽取1 h腹主動脈血，分離得到相應(yīng)劑量含藥血清，連同空白血清置于－20℃冰箱中保存。

前期預(yù)實驗顯示，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加300 μmo1／L硫酸銅銅離子模擬的銅負荷繼續(xù)培養(yǎng)TX小鼠原代肝細胞24 h時，原代肝細胞產(chǎn)生明顯細胞毒性，其凋亡明顯增加［2］；繼續(xù)培養(yǎng)24 h時，不產(chǎn)生明顯細胞凋亡作用。TX小鼠原代肝細胞由于ATP7B基因突變，導(dǎo)致銅轉(zhuǎn)運出細胞外發(fā)生障礙，引起過量銅在肝細胞內(nèi)蓄積，從而引起肝細胞毒性作用；DL小鼠原代肝細胞由于正常ATP7B基因編碼表達正常肝細胞ATP7B蛋白酶，可正常轉(zhuǎn)運肝細胞內(nèi)的銅，并不會出現(xiàn)過量銅蓄積導(dǎo)致細胞中毒作用及凋亡［2］，故用300 μmol／L硫酸銅銅離子模擬原代肝細胞銅負荷進行實驗，其配制方法為0.2495 gCuSO4·5H2O溶于10 mL DMEM中，得到含銅離子100 mmo1／L的母液， 稀釋至300 μmo1／L后再加入 DMEM 培養(yǎng)基［7-8］。

2.2 肝細胞培養(yǎng) 采用兩步灌注法分離和取TX、DL小鼠肝細胞，DMEM培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，在37.1℃、6%CO2、相對飽和空氣濕度條件下進行細胞培養(yǎng)，肝細胞呈貼壁生長，3.5 h后更換培養(yǎng)基。

2.3 分組及給藥 設(shè)置有正常組、對照組、Salubrinal組及肝豆靈片低、中、高劑量組，其中正常組為DL小鼠分離的原代肝細胞，在用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加用硫酸銅模擬的銅負荷；對照組為TX小鼠分離的原代肝細胞，在用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加用硫酸銅模擬的銅負荷；肝豆靈片組為TX小鼠分離的原代肝細胞，在用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加用硫酸銅模擬的銅負荷，加入通過原子吸收法檢測的低、中、高劑量肝豆靈含藥血清；Salubrinal組為TX小鼠分離的原代肝細胞，在用含10%血清培養(yǎng)基培養(yǎng)的基礎(chǔ)上加用硫酸銅模擬的銅負荷，然后加入Salubrinal繼續(xù)培養(yǎng)，6組培養(yǎng)原代肝細胞24 h。

2.4 肝細胞凋亡檢測 取指數(shù)生長期的DL、TX小鼠原代肝細胞，按 “2.3”項下方法分組，通過流式細胞儀檢測肝細胞凋亡。

2.5 PERK、p-eIF2a蛋白表達檢測 取指數(shù)生長期的DL、TX小鼠原代肝細胞，按 “2.3”項下方法分組，通過Western Blot法檢測肝細胞PERK、p-eIF2a蛋白表達，然后進行灰度值比對。

2.6 CHOP mRNA水平檢測 取指數(shù)生長期的DL、TX小鼠原代肝細胞，按 “2.3”項下方法分組，通過RT-PCR法檢測肝細胞CHOP mRNA水平。

2.7 統(tǒng)計學(xué)分析 通過SPSS 21.0軟件進行處理，數(shù)據(jù)以（±s） 表示，組間資料比較采用t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 肝豆靈片對原代肝細胞凋亡的影響 圖1顯示，與正常組比較，對照組原代肝細胞凋亡率顯著增加 （P＜0.01），而肝豆靈片組呈劑量依賴性地顯著抑制其凋亡 （P＜0.05，P＜0.01）。

3.2 肝豆靈片對PERK蛋白表達的影響 圖2顯示，與正常組比較，對照組PERK蛋白表達 （P＜0.01）顯著增加，而肝豆靈片組呈劑量依賴性地顯著抑制其蛋白表達 （P＜0.05， P＜0.01）。

3.3 肝豆靈片對p-eIF2a蛋白表達的影響 圖3顯示，與正常組比較，對照組 p-eIF2a蛋白表達顯著增加 （P＜0.01），而肝豆靈片組呈劑量依賴性地顯著抑制其蛋白表達 （P＜0.05， P＜0.01）。

圖1 肝豆靈片對原代肝細胞凋亡的影響 （n＝3）

圖2 肝豆靈片對PERK蛋白表達的影響 （n＝3）

圖3 肝豆靈片對p-eIF2a蛋白表達的影響 （n＝3）

3.4 肝豆靈片對CHOP mRNA水平的影響 圖4顯示，與正常組比較，對照組 CHOP mRNA水平顯著增加 （P＜0.01），而肝豆靈片組呈劑量依賴性地顯著降低其mRNA水平 （P＜0.05， P＜0.01）。

圖4 肝豆靈片對CHOP mRNA水平的影響 （n＝3）

4 討論

Wilson病在我國也稱為肝豆狀核變性，是少見的可治療的常染色體隱性遺傳性銅代謝障礙性疾病，其最常見臨床特點之一是肝損害，銅在肝臟中的過量蓄積是最主要原因，但其引起肝細胞凋亡的確切分子病理機制尚不明確［9］。近年研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是銅沉積引起肝損害的新的潛在機制之一，Wilson病發(fā)生過程存在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，并且肝細胞功能恢復(fù)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激緩解也密切相關(guān)的［2］。長期銅過量蓄積在肝細胞可引起肝細胞內(nèi)過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，從而誘發(fā)和激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)的凋亡途徑，損傷肝細胞功能，最終則引起其凋亡［2］。當機體長期處于高銅環(huán)境的情況下時，會引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)、脂質(zhì)代謝異常、鈣離子超載等細胞內(nèi)環(huán)境紊亂，均會引起過度內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，會觸發(fā)細胞內(nèi)未折疊蛋白質(zhì)反應(yīng) （UPR）［10］。

UPR可通過解除GRP78與3種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白的結(jié)合，從而啟動下游信號通路，PERK蛋白是三者之一，受到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激而激活分離出的PERK蛋白又能誘導(dǎo)CHOP蛋白表達，它為細胞凋亡途徑的重要標志性蛋白，隨后內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激持續(xù)過度存在將繼續(xù)激活半胱天冬酶級聯(lián)反應(yīng)，最終引起肝細胞凋亡［11-13］。前期預(yù)實驗顯示，原代肝細胞PERK／eIF2α凋亡信號通路是肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中最主要的，故本實驗選擇內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激中該凋亡信號通路作為研究對象，發(fā)現(xiàn)硫酸銅模擬的銅負荷可引起肝細胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，最終導(dǎo)致肝細胞凋亡，而肝豆靈片可抑制上述現(xiàn)象，并且可顯著抑制TX小鼠原代肝細胞凋亡及PERK、p-eIF2a蛋白表達，顯著降低CHOP mRNA水平，這些分子均為PERK／eIF2α／CHOP凋亡信號通路的關(guān)鍵信號物質(zhì)。

中醫(yī)認為［14］，Wilson病的外在病因為銅中毒，其主要內(nèi)在病因為先天稟賦不足，機體陰陽平衡失調(diào)，臟腑功能紊亂，從而導(dǎo)致肝氣不能正常疏泄，膽汁不能正常分泌，氣運不能通達，最終導(dǎo)致銅毒邪內(nèi)蘊不能正常向外排泄，蘊積體內(nèi)化瘀化熱，并且產(chǎn)生銅中毒，銅濁毒邪蓄積于人體各個臟腑、組織并產(chǎn)生相應(yīng)癥狀，若毒邪經(jīng)久不去，停滯于體內(nèi)，則損傷臟腑及經(jīng)絡(luò)，積聚不能散除，經(jīng)脈絡(luò)脈閉塞，氣運不暢，從而氣機阻滯，痰隨氣阻，血行不暢，痰濁與瘀血相結(jié)，故該病的主要病理機制為銅毒邪內(nèi)蘊體內(nèi)，痰濁瘀血阻滯經(jīng)脈。安徽中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院院內(nèi)制劑肝豆靈片具有清熱解毒、化瘀通腑的作用［14］，由川黃連、紫丹參、血風(fēng)藤、蜀大黃、蓬莪術(shù)、毛姜黃等藥材組成，具有保護Wilson病模型TX小鼠肝細胞功能的作用［15］，其機制可能與上調(diào)肝細胞組織miRNA-122表達有關(guān)；對銅負荷大鼠肝細胞損傷具有較好的干預(yù)作用，其機制可能與下調(diào) Bax表達、上調(diào) Bcl-2表達有關(guān)［16］；對Wilson病模型銅負荷大鼠的肝細胞的損傷具有一定保護及修復(fù)作用，其機制可能與調(diào)節(jié)膽汁酸和氨基酸代謝、改善脂質(zhì)代謝有關(guān)［17］；近年來還發(fā)現(xiàn)，它減輕銅負荷大鼠肝細胞的保護作用機理可能與下調(diào)肝細胞組織NF1cB和Caspase-3表達、抑制肝細胞凋亡相關(guān)［18］，與本實驗結(jié)果基本一致。由此可認為，肝豆靈片改善Wilson病小鼠肝損害作用與其清熱解毒、化瘀通腑、解毒排銅功效有關(guān)，分子生物學(xué)機制主要是通過干預(yù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 PERK／eIF2α／CHOP凋亡信號通路來保護肝細胞。

然而，本實驗未檢測代表細胞凋亡外源性途徑［19］、線粒體途徑等相應(yīng)關(guān)鍵信號通路標志物的表達［20］，無法明確在銅負荷誘導(dǎo)肝細胞凋亡過程中2種途徑的作用，以及兩者與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑信號通路相關(guān)交叉作用，需作進一步實驗研究。