何 帥， 馬曉杰， 賀 蕊， 龔慕辛， 石晉麗?

（1.北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，北京102488；2.首都醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，北京100069）

隨著社會(huì)競(jìng)爭(zhēng)日趨激烈及生活壓力不斷加大，焦慮癥已成為常見病和多發(fā)病。蜘蛛香為敗醬科纈草屬植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根及根莖，又名馬蹄香、鬼見愁、豆菜根等，具有理氣和中、散寒除濕、活血消腫功效，用于治療脘腹脹痛、嘔吐泄瀉、風(fēng)寒濕痹、小兒疳積等［1-3］，其化學(xué)成分包括環(huán)烯醚萜、黃酮、苯丙素、揮發(fā)油等［4-5］，具有抗焦慮、抗抑郁、鎮(zhèn)靜催眠、鎮(zhèn)痛、抑制胃腸道痙攣、細(xì)胞毒性、抗腫瘤等作用［6］。

研究表明，蜘蛛香35%乙醇提取物具有明確的抗焦慮藥效，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。因此，本實(shí)驗(yàn)考察該提取物腸吸收特性，以期全面考察蜘蛛香臨床療效的物質(zhì)基礎(chǔ)，也為中藥整體質(zhì)量評(píng)價(jià)研究提供新思路。

1 材料

1.1 儀器 HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋 （金壇市杰瑞爾電器有限公司）；BT100-1F蠕動(dòng)泵 （保定蘭格恒流泵有限公司）；電子分析天平 （十萬分之一，德國Sartorius公司）；Waters 2695-2996高效液相色譜系統(tǒng)、Empower工作站 （配置四元梯度泵、自動(dòng)進(jìn)樣器，美國 Waters公司）；TTL-DCⅡ型氮吹儀（北京同泰聯(lián)科技發(fā)展有限公司）；H1650臺(tái)式高速離心機(jī) （長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司）；KQ-100E超聲波清洗器 （昆山市超聲儀器有限公司）；冷凍干燥機(jī) （北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；氮?dú)?（北京日月金鐸氣體有限公司）。

1.2 試藥 新綠原酸 （批號(hào)MUST-17011001）、綠原酸 （批號(hào)MUST-17030620）、隱綠原酸 （批號(hào)MUST-17022403）、異綠原酸A （批號(hào)17030621）、異綠原酸B （批號(hào)MUST-15081411）、橙皮苷 （批號(hào)MUST-17032502）、異綠原酸 C（批號(hào) MUST-15081414）對(duì)照品均購自成都曼斯特生物科技有限公司。氯化鉀、氯化鈉、碳酸氫鈉、磷酸二氫鈉、葡萄糖、氯化鎂、氯化鈣均為分析純 （北京化學(xué)試劑公司）；乙腈、甲醇均為色譜純 （美國Fisher公司）；純凈水 （杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）。蜘蛛香采自云南永平，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)石晉麗教授鑒定為敗醬科植物蜘蛛香Valeriana jatamansi Jones的干燥根莖和根。

1.3 動(dòng)物 SPF級(jí)SD大鼠，雄性，體質(zhì)量（280±20）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，動(dòng)物許可證號(hào)SCXK（京）2016-0006，飼養(yǎng)于動(dòng)物房 ［室溫 （22±2）℃、相對(duì)濕度 50%左右］，自由攝食飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液制備

2.1.1 Krebs-Ringer緩沖液 （K-R液） 參考文獻(xiàn) ［7］ 報(bào)道。

2.1.2 對(duì)照品溶液 精密稱取各對(duì)照品，無水甲醇配制成1.0 mg／mL貯備液，混合后制成不同質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，即得。

2.1.3 供試品溶液 藥材粉碎后過3號(hào)篩，10倍量35%乙醇分別回流提取0.5、1.5、1 h，趁熱抽濾，合并濾液，60℃減壓回收乙醇，轉(zhuǎn)移至蒸發(fā)皿中，65℃烘箱中真空干燥，得干膏，粉碎研磨后備用。臨用前精密稱取適量，K-R液超聲溶解30 min， 配制成低（0.05 g／mL）、 中 （0.1 g／mL）、高 （0.15 g／mL） 質(zhì)量濃度混懸液 （均以生藥量計(jì)）， 4 500 r／min 離心 10 min， 澄清液經(jīng)0.45 μm微孔濾膜過濾，即得，置于液相小瓶中備用。

2.2 手術(shù)取樣 參考文獻(xiàn) ［8-9］報(bào)道。

2.3 樣品處理 取各時(shí)間點(diǎn)樣品200 μL，冷凍干燥后加 200 μL甲醇渦旋混勻，超聲 30 min后4 500 r／min離心 10 min， 取上清液， 0.22 μm 微孔濾膜過濾待測(cè)。

2.4 色譜條件 采用HPLC分析。Agilent ZORBAXSB-C18色譜柱 （4.6 mm×250 mm， 5 μm）； 流動(dòng)相乙腈 （A）-水 （含0.1%甲酸） （B）， 梯度洗脫（0～8 min， 2% ～5%A； 8～12 min， 5%A； 12～25 min， 5% ～12.5%A； 25～47 min， 12.5% ～18%A； 47～68 min， 18% ～30%A； 68～73 min， 30% ～57.5%A）；體積流量1 mL／min；柱溫30℃；檢測(cè)波長(zhǎng)285 nm；進(jìn)樣量10 μL。

2.5 Ka、Papp計(jì) 算 公 式 分 別 為 Ka＝其中l(wèi)為腸段長(zhǎng)度，r為腸段內(nèi)半徑，v為灌流速度，Cin、Cout分別為藥物進(jìn)、出口質(zhì)量濃度，Vin、Vout分別為每 15 min灌流入腸、出腸的供試液體積。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 通過SPSS 20.0軟件進(jìn)行處理，組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.7 方法學(xué)考察

2.7.1 穩(wěn)定性考察 按 “2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行在體單向腸灌流實(shí)驗(yàn)，收集空白腸灌流液，以其為溶劑溶解提取物粉末以配制藥液，置于一密閉容器中，37℃水浴孵育2 h，于0、30、120 min各取樣200 μL，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算剩余百分率，測(cè)得各成分RSD均＜3%，表明2 h內(nèi)藥液穩(wěn)定性良好。

2.7.2 專屬性考察 取空白灌流液、對(duì)照品溶液、提取物灌流液，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由圖可知，各成分峰形良好，均能得到完全分離，空白灌流液和提取物中其他成分無干擾，表明方法專屬性較好。

圖1 各成分HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.3 精密度試驗(yàn) 取腸灌流樣品，按 “2.3”項(xiàng)下方法處理，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6次，測(cè)得各成分峰面積RSD分別為新綠原酸2.66%、綠原酸2.37%、隱綠原酸2.37%、異綠原酸B 2.29%、異綠原酸A 2.34%、橙皮苷2.67%、異綠原酸C 2.32%，表明儀器精密度良好。

2.7.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取腸灌流樣品，于0、2、4、8、16、24 h在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD分別為新綠原酸1.80%、綠原酸1.55%、隱綠原酸1.93%、異綠原酸 B 1.80%、異綠原酸A 1.32%、橙皮苷1.49%、異綠原酸C 1.44%，表明灌流液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.7.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取腸灌流樣品6份，按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得各成分峰面積RSD分別為新綠原酸1.49%、綠原酸1.39%、隱綠原酸1.47%、異綠原酸B 1.39%、異綠原酸A 1.29%、橙皮苷2.02%、異綠原酸C 2.22%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7.6 線性關(guān)系考察 精密稱取各對(duì)照品適量，無水甲醇制成1.0 mg／mL貯備液，甲醇稀釋成不同質(zhì)量濃度，精密吸取200 μL，氮?dú)獯蹈珊蠹尤?00 μL空白腸灌流液，超聲30 min，冷凍干燥后加 200μL甲醇，超聲 30min充分溶解，4 500 r／min離心 10 min， 移取上清液， 0.22 μm 微孔濾膜過濾，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣10 μL測(cè)定。以峰面積為縱坐標(biāo) （Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo) （X）進(jìn)行線性回歸，結(jié)果見表1，可知各成分線性關(guān)系良好。

表1 各成分線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various constituents

2.7.7 加樣回收率試驗(yàn) 取75 min腸灌流樣品4份，1份供含有量測(cè)定用，其他3份精密加入對(duì)照品貯備液稀釋液 （50%甲醇稀釋），使對(duì)照品加入量與樣品中成分含有量基本相等，超聲混勻后按“2.3”項(xiàng)下方法處理，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、橙皮苷、異綠原酸C平均加樣回收率分別為98.88%、104.55%、98.16%、98.65%、94.78%、93.70%、89.60%，RSD分別為 6.46%、6.74%、7.96%、5.46%、2.57%、1.70%、2.26%。

2.8 腸吸收研究

2.8.1 提取物在體單向腸灌流 見圖2。

圖2 提取物HPLC色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of extract

2.8.2 吸收參數(shù) 研究表明［10］，當(dāng)某藥物在大鼠體內(nèi)的平均 Papp小于 0.18×10－3cm／min 或大于1.2×10－3cm／min時(shí)， 分別為吸收差、 吸收完全；大于0.18×10－3cm／min 但小于1.2×10－3cm／min 時(shí)，為中等吸收。

表2～3顯示，橙皮苷中、高質(zhì)量濃度 （1.0、1.5 g／mL） 下的 Papp僅略大于 0.2×10－3cm／min，吸收相對(duì)較差；隨著質(zhì)量濃度增加，異綠原酸A吸收參數(shù)有先升高后下降的趨勢(shì)，橙皮苷顯著降低（P＜0.01），而其他成分無明顯變化。

表2 各成分Ka值 （±s）Tab.2 Kavalues of various constituents（±s）

表2 各成分Ka值 （±s）Tab.2 Kavalues of various constituents（±s）

注：與 1.5 g／mL 比較，??P＜0.01

成分 Ka（×10－3／min）0.5 g／mL 1.0 g／mL 1.5 g／mL新綠原酸 4.016±0.356 4.383±0.138 4.428±0.271綠原酸 4.302±0.663 4.209±0.216 4.315±0.224隱綠原酸 3.498±0.955 3.595±0.433 3.603±0.142異綠原酸 B 3.589±0.130 3.807±0.529 3.692±0.218異綠原酸 A 4.778±1.281 5.040±0.402 3.686±0.332橙皮苷 6.280 ±1.453?? 2.233 ±0.465 2.301±0.129異綠原酸 C 4.611±0.750 4.633±0.173 4.535±0.254

表3 各成分Papp值 （±s）Tab.3 Pappvalues of various constituents（±s）

表3 各成分Papp值 （±s）Tab.3 Pappvalues of various constituents（±s）

注：與 1.5 g／mL 比較，??P＜0.01

成分 Papp［×10－3／（cm·min－1）］0.5 g／mL 1.0 g／mL 1.5 g／mL新綠原酸 0.556±0.043 0.514±0.015 0.554±0.011綠原酸 0.551±0.085 0.491±0.019 0.531±0.074隱綠原酸 0.391±0.011 0.413±0.064 0.452±0.047異綠原酸 B 0.404±0.016 0.444±0.083 0.465±0.010異綠原酸 A 0.596±0.190 0.611±0.048 0.465±0.041橙皮苷 0.799±0.187?? 0.245±0.055 0.257±0.017異綠原酸 C 0.579±0.115 0.539±0.023 0.589±0.068

2.8.3 P-糖蛋白抑制劑對(duì)提取物腸吸收特性的影響 在提取物灌流液的K-R液 （pH＝7.4）中加入P-糖蛋白抑制劑 （維拉帕米）至1.0 g／mL（相當(dāng)于中劑量組），制成混懸液，4 500 r／min離心10 min，去澄清藥液備用。按 “2.2”項(xiàng)下方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，在 “2.4”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖3。由圖可知，各時(shí)間點(diǎn)對(duì)應(yīng)的11個(gè)色譜峰峰面積較圖2明顯減小。

然后，按 “2.5”項(xiàng)下公式計(jì)算吸收參數(shù)，結(jié)果見表4～5。由表可知，加入維拉帕米后各成分吸收參數(shù)均顯著提高 （P＜0.01），其中異綠原酸A、B、 C 的 Papp大于 1.2×10－3cm／min， 表明其吸收良好。

3 討論

圖3 提取物 （含維拉帕米）HPLC色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of extract（including verapamil）

表4 各成分 （含維拉帕米）Ka值 （±s）Tab.4 Kavalues of various constituents（including verapamil） （±s）

表4 各成分 （含維拉帕米）Ka值 （±s）Tab.4 Kavalues of various constituents（including verapamil） （±s）

注：與未加維拉帕米比較，??P＜0.01

成分 Ka（×10－3／min）1.0 g／mL 1.0 g／mL（含維拉帕米）新綠原酸 4.383±0.138 7.049±0.408??綠原酸 4.209±0.216 7.690±1.548??隱綠原酸 3.595±0.433 6.494±1.181??異綠原酸 B 3.807±0.529 8.421±0.825??異綠原酸 A 5.040±0.402 7.808±1.071??橙皮苷 2.233±0.465 5.551±0.159??異綠原酸 C 4.633±0.173 9.477±1.052??

表5 各成分 （含維拉帕米）Papp值 （±s）Tab.5 Pappvalues of various constituents（including verapamil） （±s）

表5 各成分 （含維拉帕米）Papp值 （±s）Tab.5 Pappvalues of various constituents（including verapamil） （±s）

注：與未加維拉帕米比較，??P＜0.01

成分 Papp［×10－3／（cm·min－1）］1.0 g／mL 1.0 g／mL（含維拉帕米）新綠原酸 0.514±0.015 0.976±0.053??綠原酸 0.491±0.019 1.095±0.027??隱綠原酸 0.413±0.064 0.894±0.106??異綠原酸 B 0.444±0.083 1.253±0.215??異綠原酸 A 0.393±0.094 1.419±0.635??橙皮苷 0.245±0.055 0.745±0.066??異綠原酸 C 0.539±0.023 1.835±0.548??

研究表明，蜘蛛香35%、95%乙醇提取物均具有明顯抗焦慮作用，且前者更穩(wěn)定，并發(fā)現(xiàn)其中含有黃酮類成分，如50 mg／kg橙皮苷具有抗焦慮活性，但其藥效物質(zhì)基礎(chǔ)不明確［11-12］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，蜘蛛香35%乙醇提取物中新綠原酸、綠原酸、隱綠原酸、異綠原酸B、異綠原酸A、橙皮苷、異綠原酸C均可吸收入腸，為中等吸收，初步認(rèn)為是有效成分，其中綠原酸、新綠原酸存在良好的吸收。文獻(xiàn) ［13-14］報(bào)道，綠原酸在小腸中可通過存在于腸道黏膜刷狀緣的β-葡糖糖酶、酯酶的水解作用斷裂酯鍵，分別形成奎尼酸、咖啡酸，后者可部分被腸道吸收，而未被吸收者發(fā)生甲基化反應(yīng)生成阿魏酸和異阿魏酸，被吸收或經(jīng)肝臟排出體外，推測(cè)提取物中其他成分可能通過影響小腸中相關(guān)酶的活性來影響綠原酸吸收。另外，橙皮苷、異綠原酸A吸收受其質(zhì)量濃度抑制，表明其吸收機(jī)制可能為主動(dòng)運(yùn)輸；其余5種成分吸收不受其質(zhì)量濃度影響，為自由擴(kuò)散。

P-糖蛋白為限制藥物腸道吸收的主要因素，與藥物結(jié)合時(shí)能使后者外排出細(xì)胞而影響吸收，導(dǎo)致其質(zhì)量濃度降低，影響藥效發(fā)揮［15］。在蜘蛛香35%乙醇提取物溶液中加入P-糖蛋白抑制劑維拉帕米后7種成分的吸收參數(shù)均增大，表明它們均為P-糖蛋白底物。維拉帕米可通過抑制P-糖蛋白對(duì)各成分的外排泵作用來提高其在小腸的吸收，但促進(jìn)程度不同，表明與后者的結(jié)合能力存在差異。