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        microRNA-122和microRNA-146a聯(lián)合檢測有望用于布病診斷①

        2019-04-01 05:35:34梁志娜陳雅婧于玖軒周玉美鄭源強石艷春
        中國免疫學雜志 2019年5期
        關鍵詞:水平檢測

        梁志娜 陳雅婧 于玖軒 周玉美 鄭源強 石艷春

        (內(nèi)蒙古醫(yī)科大學內(nèi)蒙古自治區(qū)分子生物學重點實驗室,呼和浩特 010058)

        布魯氏菌病(簡稱布病)是一種由布氏菌感染所致、全球廣泛流行的自然疫源性人畜共患病,為我國法定乙類傳染病。近年來,我國布病疫情持續(xù)高發(fā),由傳統(tǒng)疫區(qū)逐步擴散到全國所有區(qū)省市,而且有愈演愈烈之勢,已經(jīng)成為重大公共衛(wèi)生安全問題之一[1]。由于缺乏典型的癥狀,臨床上布病容易被誤診或延遲診斷,導致疾病慢性化,難以治愈。研究表明,核酸檢測可用于布病早期診斷,使診斷窗口前移[2]。但臨床樣本中布氏菌的濃度極低,并且血清抗體與細菌DNA水平之間一致性不高,因而布氏菌核酸檢測用于布病診斷及預后評估的前景仍有待研究。

        microRNAs(miRNAs)是一類約為22個核苷酸大小的非編碼單鏈RNA,對多種生物功能具有重要的調節(jié)作用[3-5]。近年來,miRNAs與疾病發(fā)生、發(fā)展的關系以及miRNAs作為疾病診斷與預后判斷的生物標記等研究取得了許多重要進展[6,7]。然而,miRNAs在感染性疾病尤其是細菌感染所致疾病中的作用還研究較少。前期研究中,我們利用由布病患者和符合要求的健康志愿者血漿樣本組成的混合樣本和訓練樣本,采用熒光定量PCR方法分別檢測了與固有免疫功能相關的14種microRNA的表達水平。結果發(fā)現(xiàn),布病患者miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a的表達明顯受到抑制,但這些miRNAs能否成為布病診斷標記尚需進一步研究[8]。本研究中,我們將利用驗證樣本對上述5種miRNAs的表達情況及其作為布病診斷標記的可行性進行研究。

        1 材料與方法

        1.1材料

        1.1.1臨床資料與主要試劑 2018年3~5月期間在布病門診收集的確診布病患者全血和血清樣本,并分為兩組即經(jīng)過抗生素治療組和未經(jīng)抗生素治療組。血清樣本收集后采用試管凝集試驗(SAT)進行抗體滴度檢測。全血樣本(2 ml)于-20℃保存。健康志愿者與布病患者來自同一地區(qū)(性別和年齡均符合要求),經(jīng)SAT檢測確認為非布病患者。RNA提取試劑盒(南京命碼生科科技有限公司)、TaqMan miRNA PCR Kit(ABI公司)、rTaq DNA Polymerase[寶生物工程(大連)有限公司]、人工合成的人miRNAs模擬物(上海吉瑪制藥技術有限公司);PCR擴增所需引物[生工生物工程(上海)股份有限公司]。

        1.1.2樣本 驗證樣本由56例未經(jīng)治療的布病患者和40例年齡、性別和臨床表現(xiàn)均符合要求的健康志愿者組成。同時,為了考察抗生素治療是否會影響患者血漿miRNAs的表達水平,特別增加了一組32例經(jīng)過抗生素治療的布病患者樣本。

        1.2方法

        1.2.1血漿制備及RNA提取 全血樣本經(jīng)1 600 g離心10 min獲得血漿上清。利用RNA提取試劑盒從100 μl血漿樣本中提取總RNA。100 μl血漿樣本與300 μl無RNase水、200 μl苯酚和200 μl氯仿混勻,渦旋混勻后于室溫條件下放置15 min?;旌衔镉?2 000 g離心10 min后收集位于上層的水相層。加入1/10體積的3 mol/L醋酸鈉溶液和2倍體積的異戊醇。置于-20℃中1 h以沉淀總RNA。16 000 g 離心20 min收集RNA,75%乙醇洗滌1次,室溫干燥10 min后重溶于20 μl無RNase水。

        1.2.2定量RT-PCR(qRT-PCR) 采用探針法,操作方法按試劑盒說明書進行。為了計算目標miRNAs的表達水平,合成了一系列已知濃度的miRNAs寡核苷酸用水稀釋后進行反轉錄和擴增。目標miRNAs的表達水平參比標準曲線進行計算。

        2 結果

        2.1miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在驗證樣本中的表達情況 前期利用混合樣品和訓練樣品得到的實驗結果表明,miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a在布病患者中的表達水平明顯降低,且差異具有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。我們進一步利用驗證樣本評估這5種miRNAs的表達情況,驗證樣本的資料信息見表1。驗證實驗結果表明,miR-122、miR-146a和miR-155在未經(jīng)治療的布病患者和健康志愿者之間的表達水平差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01、P<0.001和P=0.000),而miR-301a和miR-145a的表達水平在兩組人群之間的差異不具有統(tǒng)計學意義(圖1)。實驗結果還顯示,經(jīng)過抗生素治療組和未經(jīng)抗生素治療組布病患者miR-122、miR-146a和miR-155的表達量均低于健康志愿者(P<0.05),但兩組患者之間這3種miRNAs表達水平的差異不具有統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

        2.2miRNAs表達水平與抗體滴度的關系 根據(jù)標準試管凝集試驗(standard SAT)的檢測結果,抗體滴度分為1∶50,1∶100和1∶200三個組。通過檢測未經(jīng)抗生素治療組患者血清miRNAs表達水平與抗體滴度之間的關系,結果發(fā)現(xiàn)只有miR-122的表達水平與抗體滴度之間存在顯著性關系(圖2A)。假設根據(jù)抗體水平將樣本分為陽性或者陰性樣本(分別以1或者0表示)進行分析,則抗體水平與miR-146a和miR-122之間存在顯著性關系(圖2B)。進一步實驗發(fā)現(xiàn),僅有miR-122與其他4種miRNAs的表達水平之間存在顯著性差異(圖2C)。通過比較miR-122、miR-146a和miR-155在有無明顯臨床表征的兩組患者血漿表達水平發(fā)現(xiàn),這些miRNAs的表達水平與患者是否具有發(fā)熱、出汗、乏力、關節(jié)和腿疼痛等之間無明顯相關性(圖3)。

        表1 驗證樣本相關信息Tab.1 Demography of validation panel

        圖1 miRNAs在治療組或未經(jīng)治療組布病患者及健康志愿者之間的表達情況Fig.1 Concentration comparisons of miRNAs between treated/untreated brucellosis patients and healthy volunteers

        圖2 miRNAs表達水平與抗體滴度之間的關系Fig.2 Correlations between miRNAs expression level and SAT titers

        2.3miR122和miR146a作為布病診斷生物標記的準確性評估結果 通過進一步分析以評估m(xù)iRNAs作為布病診斷生物標記的可行性。根據(jù)驗證樣本(未經(jīng)抗生素治療組和健康志愿者組樣本)的檢測結果,采用AUC(Area under the receiver operating characteristic curve)對診斷的準確性進行評估。5種miRNAs的AUC計算結果見表2。miR-122、miR-146a和miR-155(這3種miRNAs在驗證樣本實驗中均已被證實在布病患者中的表達量顯著下降)用于進行診斷的準確性評估試驗。結果表明:miR-122、miR-146a和miR-155的AUC值分別為0.851 1、0.795 0和0.863 6。由于miR-122和miR-146a在布病患者和健康志愿者中的表達量差異存在顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001)(圖1),這兩種miRNAs更適于作為診斷標記。miR-122和miR-146a組合的AUC值為0.935,高于兩者任何一個單獨的AUC值,因此這一組合具有更好的診斷精度(圖4)。

        圖3 miRNAs表達水平與主要臨床表征之間的關系Fig.3 miRNAs levels comparison between subjects with/without a specific symptom

        表2 microRNA的AUC統(tǒng)計結果Tab.2 Statistics of AUC of different microRNAs

        圖4 miR-122和miR-146a單獨或組合AUC值Fig.4 AUC value for either or combination of miR-122 and miR-146a

        3 討論

        由于布病患者通常不具有典型的臨床癥狀,如不能及時確診和治療,極易形成慢性、遷延性疾病。當前,布病的早期確診面臨著很大挑戰(zhàn)。血清或血漿中miRNAs的表達水平往往與宿主狀態(tài)存在密切關系并且具有良好的穩(wěn)定性,已經(jīng)或有望成為許多疾病診斷和預后判斷的生物標記[9-11]。我們的前期研究結果已證實,5種與固有免疫相關的miRNAs(miR-122、miR-145a、miR-155、miR-301a和miR-146a)在布病患者體內(nèi)的表達水平明顯降低。

        本研究中,我們利用驗證樣本進一步評估這5種miRNAs在布病確診患者和健康志愿者之間表達水平的差異、血清抗體滴度和臨床表現(xiàn)的關系,通過計算AUC值考察不同miRNAs單獨或組合檢測用于布病診斷的可行性。試驗中還特別增加了一組經(jīng)過抗生素治療的布病患者樣本,以便探討抗生素治療是否會影響患者血漿miRNAs的表達水平。研究結果表明,miR-122、miR-146a和miR-155在未經(jīng)治療的布病患者和健康志愿者之間的表達水平差異具有統(tǒng)計學意義,而在未經(jīng)治療和經(jīng)抗生素治療的兩組布病患者之間差異不具有統(tǒng)計學意義,并且這三種miRNAs的表達水平與患者是否具有臨床表現(xiàn)沒有明顯相關性。miR-146a和miR-122的表達水平與患者血清中是否存在布氏菌抗體之間具有顯著性關系。分別計算上述5種miRNAs單獨用于布病診斷的AUC值表明,miR-122、miR-146a和miR-155具有更高的AUC值。鑒于miR-122和miR-146a在布病患者和健康志愿者中的表達水平存在顯著統(tǒng)計學意義(P<0.001),我們認為這兩種miRNAs更適于作為診斷標記。同時,miR-122和miR-146a組合的AUC值達到0.935,高于兩者任何一個單獨的AUC值,因此這一組合檢測將具有更好的診斷精度。

        近年來,miRNAs作為疾病診斷、分級和預后判斷等的生物標記研究取得了許多重要進展[12-14]。我們的研究結果提示,與固有免疫相關的miRNAs有望用于布病診斷,尤其是miR-122和miR-146a組合檢測具有很高的診斷精度和參考價值。如何進一步提高microRNAs用于布病診斷的便捷性和精確性以及此類標記能否作為布病預后判斷尚需進一步研究。

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