王連慧，李俊廣，宋良偉，張娜

(1.山東大學藥學院，山東 濟南 250100；2.山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司，山東 臨沂 276017)

依達拉奉注射液是由日本三菱制藥公司開發(fā)并于2001年4月獲日本厚生省批準上市，規(guī)格為20 mL：30 mg，商品名為Radicut[1]，具有清除自由基和抑制脂質(zhì)過氧化的作用，2003年進入中國，目前已有多家國產(chǎn)依達拉奉注射液上市。注射液有關(guān)物質(zhì)檢查是非常重要的一項質(zhì)量控制指標，基于雜質(zhì)譜進行本品有關(guān)物質(zhì)研究目前尚無文獻報道，本文結(jié)合本品所用原料藥的雜質(zhì)概況、制劑處方工藝、降解途徑研究結(jié)果和相關(guān)文獻資料對本品的雜質(zhì)譜進行全面分析(見表1)，在雜質(zhì)分析的基礎(chǔ)上，采用相應(yīng)的雜質(zhì)對照品對雜質(zhì)分析方法進行系統(tǒng)的方法學驗證，證明了所用的有關(guān)物質(zhì)檢測方法確實能有效地分離檢出依達拉奉注射液中可能存在的雜質(zhì)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 XS105電子天平(梅特勒)；島津LC-20AT高效液相色譜儀(配置二極管陣列、紫外檢測器)。

1.2 試藥 依達拉奉注射液(山東羅欣藥業(yè)集團股份有限公司，批號∶170301、170302、170303，規(guī)格20 mL：30 mg)；依達拉奉注射液(日本田邊三菱制藥株式會社，A073)；依達拉奉對照品(中國食品藥品檢定研究院)；二聚體(深圳斯坦德)；三聚體(深圳斯坦德)；雜質(zhì)P1(中國食品藥品檢定研究院)、雜質(zhì)P3(深圳斯坦德)；雜質(zhì)1、雜質(zhì)2均為自制；甲醇(色譜純，禹王集團)；磷酸二氫鉀、磷酸、三乙胺(國藥集團)均為分析純試劑；水為純化水。

表1 依達拉奉雜質(zhì)譜[2-3]

2 方法與結(jié)果

2.1 方法

表2 液相梯度洗脫表

2.1.2 溶液配制 取本品適量，加溶劑[0.05 mol·L-1磷酸二氫鉀溶液(用磷酸調(diào)pH值至3.5)-甲醇(50∶50)]稀釋制成每1 mL中約含依達拉奉0.5 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用溶劑稀釋制成每1 mL中約含依達拉奉0.5 μg的溶液，搖勻，作為對照溶液。

2.2 結(jié)果

2.2.1 專屬性

2.2.1.1 空白干擾試驗 精密量取空白溶劑、空白輔料溶液和供試品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖，空白溶劑及空白輔料對本品有關(guān)物質(zhì)檢查無干擾，各雜質(zhì)峰與其他峰分離度均大于2.0，能完全分離。

2.2.1.2 強降解試驗 取依達拉奉注射液在各苛刻試驗條件(酸、堿、氧化、高溫、光照)下進行破壞、降解，同時做空白輔料作為對照，按照本方法分別進行測定，結(jié)果見表3。

試驗結(jié)果表明，本品在氧化條件下雜質(zhì)個數(shù)及雜質(zhì)含量增加明顯，說明本品在氧化條件下有明顯的降解，其他破壞條件下均較穩(wěn)定；本方法輔料均無干擾，對各雜質(zhì)分離良好，對測定無干擾，專屬性符合要求，各個破壞條件下峰純度符合要求，適于本品的有關(guān)物質(zhì)檢查。

2.2.2 檢測限與定量限 精密稱取依達拉奉與各雜質(zhì)對照品適量，分別加甲醇溶解并稀釋至信噪比約為10∶1，作為定量限溶液，連續(xù)進樣6針，精密度良好；分別精密量取各定量限溶液3 mL，置10 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，信噪比約為3∶1作為檢測限溶液，分別精密量取各20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，結(jié)果見表4。

表4 檢測限與定量限試驗結(jié)果

2.2.3 線性關(guān)系、校正因子的考察 精密稱取依達拉奉和各雜質(zhì)對照品適量，加甲醇溶解并用稀釋劑制成一系列濃度的溶液，分別精密量取上述溶液各20 μL，注入液相色譜儀，測定峰面積。以濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標進行線性回歸，結(jié)果見表5。

結(jié)果表明：主成分與各雜質(zhì)在一定的范圍內(nèi)，其濃度與峰面積成良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.999。雜質(zhì)P1、雜質(zhì)P3響應(yīng)值與依達拉奉差異較大，對雜質(zhì)P1和雜質(zhì)P3的控制采用外標法。其他雜質(zhì)校正因子均在0.9～1.1之間，采用不加校正因子的自身對照法測定其含量。

表5 線性試驗結(jié)果

2.2.4 進樣精密度試驗 取依達拉奉及各雜質(zhì)線性關(guān)系試驗項下的中間濃度溶液，作為供試品溶液。精密量取20 μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進樣6次，記錄色譜圖，計算6次峰面積的RSD，結(jié)果見表6。

表6 精密度試驗結(jié)果

結(jié)果表明主成分與各雜質(zhì)RSD均小于2.0%，精密度符合要求，本法進樣精密度良好。

2.2.5 重復(fù)性試驗 取本品，按照“2.1”項下的方法測定，重復(fù)本試驗6次，雜質(zhì)P1、 P3按外標法以峰面積計算，其他雜質(zhì)采用不加校正因子的自身對照法計算，試驗結(jié)果見表7。

表7 重復(fù)性試驗結(jié)果

由以上數(shù)據(jù)可得，重復(fù)本試驗6次，所檢出雜質(zhì)個數(shù)一致及雜質(zhì)含量基本一致，即本法重復(fù)性良好。

2.2.6 中間精密度試驗 由不同人員在不同時間、不同儀器，分別進行重復(fù)性試驗，雜質(zhì)P1、 P3按外標法以峰面積計算，其他雜質(zhì)采用不加校正因子的自身對照法計算，由不同人員在不同時間、不同儀器進行檢驗，雜質(zhì)個數(shù)一致，雜質(zhì)含量基本一致，本法中間精密度良好。

2.2.7 溶液穩(wěn)定性 取依達拉奉注射液適量，用溶劑稀釋制成每1 mL中約含0.5 mg的溶液，搖勻，作為供試品溶液；供試品溶液室溫下(約25 ℃)放置，于0、2、4、6、8、10、12 h時，精密量取20 μL，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按面積歸一化法計算，試驗結(jié)果表明，本品室溫放置12 h各雜質(zhì)個數(shù)沒有變化，雜質(zhì)含量變化均小于0.02%，穩(wěn)定性良好。

2.2.8 準確度 分別精密稱取依達拉奉各雜質(zhì)對照品各約5 mg，置同一100 mL量瓶內(nèi)，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為混合雜質(zhì)對照品貯備液，精密量取混合雜質(zhì)對照品貯備液1.6 mL(80%)、2.0 mL(100%)、2.4 mL(120%)各3份，分別置9個20 mL量瓶內(nèi)，精密量取注射液5 mL，分別置上述量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為加樣供試品溶液，精密量取混合雜質(zhì)對照品貯備液2 mL置20 mL量瓶中，加溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為混合雜質(zhì)對照品溶液；精密量取注射液5 mL，置20 mL量瓶中，用溶劑稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取混合雜質(zhì)對照品溶液、供試品溶液、加樣供試品溶液各20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖。按外標法以峰面積計算各雜質(zhì)的回收率，結(jié)果見表8。

表8 準確度試驗結(jié)果

試驗結(jié)果表明：各雜質(zhì)平均回收率均在90%以上，RSD均小于10%，表明本法的準確度可靠。

2.2.9 耐用性試驗 為考察本方法對條件發(fā)生微小變化的耐受程度，采用不同廠家儀器、不同品牌色譜柱、不同柱溫(30±5)℃、不同流速(1.0±0.1)mL·min-1、不同波長(243±2)nm、不同pH(7.0±0.2)等因素對方法的耐用性進行考察，分別精密量取供試品溶液、混合溶液20 μL，注入液相色譜儀，記錄色譜圖。試驗結(jié)果表明各雜質(zhì)峰與其他成分峰均達到基線分離；雜質(zhì)檢出個數(shù)和總量基本一致，本方法耐用性良好。

2.2.10 樣品測定及結(jié)果 分別取本品3批及原研制劑1批，加溶劑稀釋制成每1 mL中約含0.5 mg的溶液，作為供試品溶液；精密量取供試品溶液適量，用溶劑稀釋制成每1 mL中約含0.5 μg的溶液，搖勻，作為對照溶液。另取雜質(zhì)P1和雜質(zhì)P3對照品各適量，分別加少量甲醇溶解后，用溶劑稀釋制成每1 mL中含P1約2 μg、P3約1 μg的溶液，作為對照品溶液。照上述確定的色譜條件進行測定，結(jié)果見表9。

表9 樣品測定結(jié)果

3 討論

3.1 檢測方法的選擇 已有文獻報道[4-8]采用HPLC法測定依達拉奉有關(guān)物質(zhì)，但沒有針對雜質(zhì)譜進行依達拉奉注射液有關(guān)物質(zhì)的研究，本文針結(jié)合本品所用原料藥的雜質(zhì)概況、制劑處方工藝、降解途徑研究結(jié)果和相關(guān)文獻資料對本品的雜質(zhì)譜進行全面分析，在雜質(zhì)譜分析的基礎(chǔ)上，采用相應(yīng)的雜質(zhì)對照品對雜質(zhì)分析方法進行系統(tǒng)的方法學驗證，證明了所用的有關(guān)物質(zhì)檢測方法確實能有效地分離檢出依達拉奉注射液中可能存在的雜質(zhì)。

3.2 與原研制劑雜質(zhì)譜的比較 采用經(jīng)過驗證的有關(guān)物質(zhì)檢查方法對自制制劑和原研制劑進行雜質(zhì)譜比較，由表9試驗結(jié)果表明自制制劑的雜質(zhì)個數(shù)少于原研制劑，雜質(zhì)含量與原研制劑基本一致，說明自制制劑有關(guān)物質(zhì)控制水平與原研制劑相當。