尤梅桂，翁樂斌，吳雅茗

(1.廈門醫(yī)學院基礎醫(yī)學部，福建 廈門 361023；2.廈門醫(yī)學院機能與臨床轉化福建省高校重點實驗室，福建 廈門 361023)

肝癌是世界排名第二的最常見腫瘤,因肝癌死亡的患者中中國占超過一半。因此中國作為肝癌高發(fā)的國家,對肝癌的診療迫在眉睫。熊去氧膽酸(ursodeoxycholic acid,UDCA)是名貴中藥熊膽所含的主要有效成分，是一種較為常用的治療原發(fā)性膽汁性肝硬化的藥物[1]。近年來大量的研究發(fā)現(xiàn)熊去氧膽酸還具有多樣的抗腫瘤活性，如誘導腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖、促進細胞分化等，是一種較好的抗腫瘤候選藥物[2-3]。此外，UDCA對正常組織和細胞沒有明顯的細胞毒作用。因此，本研究旨在探討UDCA誘導人肝癌細胞BEL-7404凋亡的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 人肝癌細胞BEL-7404來源于中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所細胞庫。細胞培養(yǎng)基RPMI1640(杭州四季青生物工程材料有限公司)；小牛血清UDCA(標準品，含量99.99%，每支200 mg，Sigma產品)，陽性對照藥氟尿嘧啶(FU,Santa Cruz產品)。抗caspase-9兔抗體、抗survivin兔抗體、抗Bax兔抗體、抗Bcl-2小鼠抗體均購自Santa Cruz Biotechnology公司；抗procaspase-3兔抗體(Santa Cruz Biotechnology公司)；MK3 酶聯(lián)免疫檢測儀(美國Thermo公司)；SW-CJ-1D型醫(yī)用超凈化工作臺(蘇州凈化設備廠)；Olympus CX22生物顯微鏡(日本Olympus公司)等。

1.2 方法

1.2.1 增殖抑制試驗 用適量0.25%胰酶消化處于對數(shù)期的人肝癌細胞BEL-7404，加入培養(yǎng)基制成細胞懸液。將細胞加入96孔酶標板中，每孔100 μL，設置3個副孔，置于37 ℃恒溫、5% CO2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h左右。分別加入終濃度是20、6.66、2.22、0.75、0.25、0.08 mmol·L-1的目標化合物UDCA，加入陽性對照藥1.0 mmol·L-1FU，100 μL/孔。孵育72 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，輕輕晃勻，盡量除去氣泡。 孵育2.5 h后，用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值(A)，A值越高活細胞數(shù)也越多。根據A可計算藥物對細胞的生長抑制率。

1.2.2 光鏡形態(tài)學觀察 取對數(shù)生長期人肝癌細胞BEL-7404懸液(約含2×105個細胞)，2 mL/孔接種于6孔板中，于接種后24 h分別加入不同濃度的UDCA(終濃度分別0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)，每組3個孔，另設一組空白和一組1.0 mmol·L-1的FU作為陽性對照。處理24 h后，置于倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1.2.3 Western blot法檢測procaspase-3、9和survivin蛋白、Bax/Bcl-2 取UDCA組，陰性對照組和陽性對照在作用48 h后的細胞，加入蛋白裂解液。離心10 min，將上清轉移至離心管中。電泳：配制10% SDS-PAGE膠，上樣。80 V濃縮膠，120 V分離膠，2.5～3 h，轉膜，封閉?？贵w孵育：一抗用磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)稀釋至工作液濃度，將各條膜置于皿中用PBST清洗3次，10 min/次。用PBST稀釋二抗至工作液濃度，1 500 μL/條。按前法封袋。37 ℃恒溫搖床反應1 h。反應結束后剪開袋口，棄二抗，PBST清洗3次，10 min/次，PBS清洗10 min。于Odyssey近紅外熒光掃描儀掃描。

1.3 統(tǒng)計學處理和分析 實驗重復3次，結果用mean±SD表示。應用SPSS 11.0軟件分析，兩個樣本均數(shù)比較采用t檢驗，多樣本均數(shù)比較釆用完全隨機的單因素(One-ANOVA)方差分析，組間兩兩比較采用q檢驗。若P<0.05表示與對照組相比具有差異，P<0.01表示與對照組相比有顯著差異，P>0.05，沒有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 10 h對人肝癌細胞BEL-7404的生長抑制作用呈濃度-效應和時間-效應關系 如圖1所示，當采用不同濃度的藥物(0.08、0.25、0.75、2.22、6.66、20 mmol·L-1)處理人肝癌細胞BEL-7404細胞24、48、72 h后，IC50分別為(0.83±0.097)、(0.79±0.088)、(0.67±0.071) mmol·L-1，細胞呈不同程度的抑制作用，且這種現(xiàn)象存在一定的藥物濃度-效應關系和時間-效應關系。

2.2 光鏡觀察結果 空白對照組人肝癌細胞BEL-7404生長狀態(tài)良好，多呈梭形，貼壁生長，輪廓清晰，胞質均勻透明，細胞間結構緊密；隨培養(yǎng)時間延長形態(tài)基本變化不大。UDCA處理后，細胞的形態(tài)、貼壁能力、集落性都有不同程度改變。隨著UDCA濃度的增大，細胞膜皺縮，細胞間隙增寬，細胞體積變小，活細胞數(shù)目逐漸減少，細胞碎片也逐漸增多，部分細胞脫落、漂浮于培養(yǎng)液中。光鏡下觀察得出UDCA可以引起B(yǎng)EL-7404細胞凋亡。

2.3 Western blot結果 如圖2所示，Bcl-2蛋白表達減少且蛋白水平的變化呈一定的濃度依賴性(P<0.05)，Bax的表達變化不明顯(P>0.05)，Bax與Bcl-2蛋白的比率顯著增加，說明此時細胞趨向凋亡狀態(tài)。通過Western blot定量的觀察UDCA對procaspase-3和survivin蛋白表達的影響。如圖3所示，與空白對照組相比，UDCA細胞在給予(0.4、0.8、1.6 mmol·L-1)后，procaspase-3、survivin蛋白表達減少，提示UDCA可能是通過survivin/smac線粒體信號通路激活caspase-3、survivin的表達。

圖1 UDCA不同時間不同劑量下對BEL-7404增殖抑制的比較

圖2 UDCA對Bax和Bcl-2蛋白的影響

圖3 UDCA對 procaspase-3和survivin蛋白的影響

3 討論

Bcl-2存在于線粒體外膜，可中和Bax/Bax同源二聚體所誘導的凋亡作用。Bax作用于線粒體外膜形成孔道，改變胞膜的通透性，觸凋亡。決定細胞凋亡與否的關鍵是二者的比率，所以也將Bax和Bcl-2的比值稱為“凋亡開關”[4]。Survivin是凋亡抑制蛋白家族的新成員，survivin具有腫瘤特異性，只表達于腫瘤和胚胎組織，且與腫瘤細胞的分化增殖及浸潤轉移密切相關。研究表明[5-6]survivin廣泛高表達于HepG2、Huh7和SK-Hep1等肝癌細胞系及人肝癌組織，與肝癌細胞凋亡調控密切相關。由于survivin蛋白主要作用機制是抑制凋亡蛋白caspase-3的表達，從而降低了細胞對凋亡的抵抗性，抑制細胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)可以UDCA通過多途徑作用于肝癌細胞抑制肝癌細胞遷移和增殖。近UDCA抗癌的主要機制有：①升高促凋亡因子Bax，降低抗凋亡因子Bcl-2而誘導凋亡線粒體通路發(fā)揮抗肝癌細胞的作用[7]；②抑制凋亡抑制蛋白survivin的表達，增加caspase-3含量，從而誘導肝癌細胞凋亡[8-9]；③抑制JAK-STAT3-COX-2，拮抗IL-6誘導的肝癌細胞的增殖[10-11]。研究表明UDCA抗癌作用機制還可能與細胞增殖周期有關。

本研究結果顯示UDCA能抑制BEL-7404增殖，誘導細胞凋亡，并呈濃度、時間依賴性。CCK-8實驗結果顯示 UDCA對BEL-7404細胞增殖有明顯的抑制作用，并且隨UDCA濃度越高，對細胞增殖的抑制作用越強。作用的時間越久，對細胞增殖的抑制作用也越強。通過光鏡觀察，UDCA 可誘導BEL-7404細胞出現(xiàn)典型的凋亡形態(tài)學改變。Western blot結果表明，UDCA可誘導Bcl-2蛋白表達下降，procaspase-3和survivin蛋白表達下降。該結果提示UDCA通過誘導Bax/Bcl-2水平升高，survivin蛋白表達下降，誘導BEL-7404細胞凋亡。

綜上所述，UDAC能夠抑制BEL-7404細胞增殖和誘導其凋亡，有望成為治療肝癌的候選藥物之一，其作用機制可能與激活procaspase-3引起B(yǎng)ax/Bcl-2表達上調，同時使得survivin蛋白表達下降，減低細胞對凋亡的抵抗性有關。