武 芳，李 勇，路兆軍，王 敏，盛玉婷

（1.煙臺地元生物科技有限公司，山東 煙臺264000；2.海陽市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心，山東 海陽 265100；3.煙臺市林業(yè)科學(xué)研究所，山東 煙臺264000；4.魯東大學(xué) 農(nóng)學(xué)院，山東 煙臺 264000）

哈密瓜細(xì)菌性果斑病是由革蘭氏陰性細(xì)菌燕麥?zhǔn)人峋鞴蟻喎N (Acidovorax avenaesubsp. citrulli)引起的一種毀滅性病害，并且也是一種危險性檢疫病害，該病最早于1969年由Crall和Schenck在美國佛羅里達(dá)州發(fā)現(xiàn)，之后成為全世界的西瓜種子、幼苗和果實的一種嚴(yán)重威脅，被侵染的種子是重要的初侵染源，可造成西瓜細(xì)菌性果斑病的大面積暴發(fā)。且近些年來，其他瓜類作物，如哈密瓜、黃瓜、南瓜和西葫蘆等瓜類作物上也檢測到了該病害的發(fā)生。

內(nèi)蒙古巴彥淖爾市從1991年開始從新疆引種種植哈密瓜，種植面積高達(dá)13.3萬hm2，每年種植的品種有40～50個。因為其廣泛的種植面積，為細(xì)菌性果斑病的發(fā)生提供了基礎(chǔ)，在20世紀(jì)末開始發(fā)生該病害，每年生產(chǎn)田發(fā)病率45%～100%，經(jīng)濟損失嚴(yán)重，并有上升趨勢，已成為哈密瓜產(chǎn)業(yè)發(fā)展的首要障礙，所以，防治該病害的發(fā)生成為一種亟待解決的問題。

隨著社會的發(fā)展，經(jīng)濟水平的提高，人們越來越關(guān)注食品安全，傳統(tǒng)的化學(xué)農(nóng)藥因為其污染環(huán)境并且高殘留的特點，逐漸成為人們排斥的對象，而環(huán)境友好型的生物農(nóng)藥才是發(fā)展的趨勢。本試驗旨在研究拮抗菌株對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防治效果，從中篩選得到對該病有較好生防作用的菌株，為生產(chǎn)實踐奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗植物

本試驗所選品種為金蜜十號，由新疆寶豐種業(yè)有限公司研制，該品種屬中早熟哈密瓜品種，全生育期85 d左右，植物生長勢中等，果實橢圓形，金黃色底上覆有墨綠色斑點，中粗網(wǎng)紋布滿全瓜，桔紅肉，肉質(zhì)較脆、蜜甜，風(fēng)味佳，綜合抗性好，較耐霜霉病、抗白粉病，易感細(xì)菌性果斑病，種植區(qū)域廣泛。

1.2 試驗藥劑

72%的農(nóng)用鏈霉素，由華北制藥股份有限公司生產(chǎn)；王酮·代森鋅，由保加利亞艾格利亞有限公司生產(chǎn)。

1.3 供試生防菌株和培養(yǎng)基

生防菌株如表1中所示，菌株均來源于本公司實驗室細(xì)菌菌株庫。培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基（由南京基天生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)）。

表1 供試拮抗菌菌株

1.4 6株生防菌株培養(yǎng)方法及菌液的制備

培養(yǎng)方法：于-70 ℃冰箱中取出原始菌株，在LB平板上劃線，28 ℃下培養(yǎng)24 h，待長出單菌落，挑取其接入含有5 mL LB 培養(yǎng)液的試管中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)24 h，制成種子液；以1%的接種量將種子液接種于裝有500 mL LB 培養(yǎng)液的1 L規(guī)格的大三角瓶里，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)22～24 h。待菌液制備好之后，6 000 r/min離心30 min，棄上清液，用無菌水將沉淀重懸浮，終濃度調(diào)試為1×108cfu/mL備用。

1.5 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜苗期的促生試驗

本試驗共設(shè)置8個處理，分別為1：生防菌DY54；2：生防菌DY03；3：生防菌DY13；4：生防菌DY02；5：生防菌DY21；6：生防菌DY20；7：王酮·代森鋅；8：清水對照。每個處理4次重復(fù)，每個小區(qū)20 m2（約種植26棵瓜苗），采用隨機區(qū)組排列，各小區(qū)間設(shè)置適當(dāng)寬度的隔離行。在種子播種之前，首先用為72%的農(nóng)用鏈霉素進(jìn)行消毒處理10 min，晾干后播種。待瓜苗長到2片真葉時，用1×108cfu/mL生防菌液進(jìn)行處理。采用灌根和噴霧同時處理的方法，即在瓜苗2片真葉時，在瓜苗根圍緩緩灌入20 mL的生防菌液同時將生防菌液噴施到葉片的正反兩面，每隔15 d處理一次，在種植后35 d時統(tǒng)計其促生效果，按照5點取樣法，對瓜苗的莖粗、莖長和葉片數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計。

1.6 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防效試驗

菌液處理方法同上，待哈密瓜開始發(fā)病后，統(tǒng)計其病害，病害分級共有0、1、2、3、4、5、6共7個等級，分級標(biāo)準(zhǔn)如下：

0級：不發(fā)病；

1級：病葉上有零星病斑，病斑占葉面積的10%以下；

2極：病葉上有少量病斑，病斑占葉面積的11%～25%；

3級：病葉上病斑數(shù)量中等，病斑占葉面積的26%～50%；

4級：病葉上病斑數(shù)量較多，病斑占葉面積的51%～75%；

5級：病葉上有許多病斑，病斑占葉面積的76%～90%；6級：病葉上有大量病斑，病斑占葉面積90%以上；病害嚴(yán)重度=[Σ (病級葉片數(shù)×代表級數(shù))／葉片總數(shù)×最高代表級值]×100%；

防效=(對照發(fā)病率－處理發(fā)病率)／對照發(fā)病率×100%。

1.7 6株拮抗菌株對哈密瓜果實產(chǎn)量的影響

在果實成熟后，對每個小區(qū)的哈密瓜果實產(chǎn)量進(jìn)行統(tǒng)計，并計算其產(chǎn)量增加量。

產(chǎn)量增加量=（處理組果實質(zhì)量-對照組果實質(zhì)量）/對照組果實質(zhì)量×100%。

1.8 6株拮抗菌株對哈密瓜果實品質(zhì)的影響

哈密瓜果實成熟后，在每個小區(qū)按照五點取樣法選取5顆果實，即每個處理共選擇20顆果實進(jìn)行品質(zhì)檢測，其中哈密瓜的可溶性糖、可溶性蛋白質(zhì)、維生素C含量測定參照《植物生理生化實驗原理和技術(shù)》中提供的方法，其可溶性固形物含量用手持測糖儀（WXY2I型）進(jìn)行檢測，果肉硬度用果實硬度計（GY-B型）測定。

1.9 大田試驗中病原菌的鑒定

在田間采集哈密瓜病害葉片，采用平板劃線分離法進(jìn)行分離。取病健交界處的組織4～5 mm，先在75%的酒精里浸泡10 s，再用0.001%的升汞中消毒2～3 min，后用無菌水漂洗3次，然后將組織碾碎到1～2 mL的無菌水中，梯度稀釋，用接種環(huán)蘸取菌懸液在LB平板上劃線，在28 ℃條件下培養(yǎng)24 h，挑取單菌落到含有5 mL LB培養(yǎng)液的試管中，28 ℃、200 r/min培養(yǎng)22～24 h。

用上海賽百盛基因技術(shù)有限公司的基因組DNA快速提取試劑盒，提取細(xì)菌的基因組DNA，以提取的DNA產(chǎn)物為模板，用細(xì)菌16S rDNA擴增通用引物U8-27 [5′-AGAGTTTGATC(AC)TGGCTCAG-3′]、L1494-1514 [5′-CTACGG(AG)TACCTTGTTACGAC-3′]從 基 因 組 DNA 中 擴增出16S rDNA基因片段，將片段產(chǎn)物克隆到pMD19-T載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α后，挑取陽性單克隆，培養(yǎng)，送到測序公司測序，并BLAST比對。

2 結(jié)果與分析

2.1 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜苗期的促生結(jié)果

在哈密瓜種植35 d后對其莖粗、莖長和葉片數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計，結(jié)果表明，各處理組中哈密瓜的莖粗、莖長和葉片數(shù)較清水對照組均有不同程度的增加，而與藥劑組相比，只有DY54、DY03和DY20 3個處理組中哈密瓜的莖粗、莖長和葉片數(shù)有所增加（表2）。

表2 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜苗期的促生結(jié)果

2.2 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防效結(jié)果

在哈密瓜種植60 d后，細(xì)菌性果斑病發(fā)病達(dá)到高峰，對其發(fā)病指數(shù)和發(fā)病率進(jìn)行統(tǒng)計、計算，結(jié)果表明，各處理組的病害嚴(yán)重度和發(fā)病率均低于清水對照組，并且處理組DY54、DY03的病害嚴(yán)重度和發(fā)病率也低于藥劑組（表3、圖1）。根據(jù)對其整個發(fā)病期的發(fā)病指數(shù)的統(tǒng)計結(jié)果進(jìn)行計算（圖2），發(fā)現(xiàn)拮抗細(xì)菌DY54和DY03能夠延遲病害的發(fā)生，拮抗細(xì)菌DY54可延遲4 d，DY03可使病害延遲2 d；8月初是該病害迅速發(fā)生的時期，應(yīng)采取更進(jìn)一步的防治措施來控制該病害的傳播。

表3 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防效結(jié)果

表4 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜果實產(chǎn)量的影響

圖1 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜細(xì)菌性果斑病的防效

圖2 6株拮抗細(xì)菌處理組病害嚴(yán)重度趨勢

2.3 6株拮抗菌株對哈密瓜果實產(chǎn)量的影響

在哈密瓜果實采收時，對果實進(jìn)行稱質(zhì)量，經(jīng)統(tǒng)計計算，各處理組對果實的產(chǎn)量也有一定的促生作用，并且相對于化學(xué)對照組，除處理組DY21以外，其他能使哈密瓜的果實產(chǎn)量增加(表4)。

2.4 6株拮抗菌株對哈密瓜果實品質(zhì)的影響

哈密瓜果實成熟后，對其可溶性糖、可溶性蛋白、維生素C、可溶性固形物含量和果肉硬度等指標(biāo)進(jìn)行檢測，結(jié)果表明，各處理組也可在一定程度上改善果實的品質(zhì)，尤其在可溶性固形物含量這一指標(biāo)上表現(xiàn)明顯，并且相對于藥劑組，拮抗細(xì)菌DY54和DY03能夠提高果實品質(zhì)的所有指標(biāo) (表 5)。

2.5 病原菌的鑒定結(jié)果

在病害發(fā)生的同時，對其病葉進(jìn)行采集，經(jīng)分離鑒定，有約1 500 bp大小的16S roNA片段，經(jīng)測序、比對，與登錄號為NR 041758.1的菌株Acidovorax citrullistrain ICMP 7500 相似度達(dá)到99%。由此確定，田間發(fā)生的病害為由燕麥?zhǔn)人峋?Acidovorax avenaesubsp.citrulli)引起的細(xì)菌性果斑病。

表4 6株拮抗細(xì)菌對哈密瓜果實品質(zhì)的影響

圖3 病原菌的16SrRNA擴增結(jié)果

3 結(jié)論與討論

自細(xì)菌性果斑病發(fā)現(xiàn)以來，因為其危害重、傳播快，對瓜類生產(chǎn)造成了嚴(yán)重?fù)p失，成為人們研究的熱點，但一直以來都沒有找到有效的防治措施。生物防治作為一種新興的防治手段，成為人們的希望所在。但是在此方面研究相對還比較少，大多局限在平板拮抗或試驗條件易控制的溫室防效階段，F(xiàn)essehaie和walcott采用Pseudomonas fluorescens(A506)、非致病菌A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)和從瓜種上獲得的1株未鑒定的革蘭氏陰性細(xì)菌WS-1在西瓜花期進(jìn)行接種，經(jīng)試驗，結(jié)果表明P. fluorescens(A506)和A. avenaesubsp.avenae(AAA99-2)具有很好的生防效果，并且能有效阻止細(xì)菌性果斑病菌侵染種子，同時還發(fā)現(xiàn)A.avenaesubsp.avenae(AAA99-2)這一菌株可以提高種子的發(fā)芽率，所以認(rèn)為其具有良好的發(fā)展前景。泰國和巴西也相繼報道了用生防菌來抑制細(xì)菌性果斑病菌的發(fā)展，他們利用Bacillus mageteriumpv.cerealisRAB7、Streptomyces-84和-87進(jìn)行平板拮抗測定，表現(xiàn)出了良好的抑菌效果，但并沒有深入的做下去。前人報道了用酵母菌來防治細(xì)菌性果斑病，取得了良好的效果，但是其并沒有進(jìn)行大田試驗，不能充分說明該菌的生防效果及穩(wěn)定性。

以上研究結(jié)果表明，試驗中所選用的幾株拮抗菌株對細(xì)菌性果斑病的防治均有一定的效果，本研究所選用的拮抗菌株大多是芽孢桿菌，這可能是因為芽孢桿菌為土壤和植物微生態(tài)優(yōu)勢種群，有極強的抗逆性，被認(rèn)為是一類理想的生防菌。前人用芽孢桿菌BB11、FH17來防治辣椒疫病，達(dá)到了55.8%和37.1%的防效；用芽孢桿菌防治番茄青枯病，取得了高達(dá)90.18%的防效。這些都說明芽孢桿菌是一類極具生防潛力的菌株，可能是由于芽孢桿菌能夠誘導(dǎo)植株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性所致。另外一株拮抗菌株黏質(zhì)沙雷氏也表現(xiàn)出了一定的生防效果，由沙雷氏菌防治番茄青枯病的研究一致。但是拮抗作用究竟在以什么樣的方式起作用，還有待進(jìn)一步研究。