姚軼俊 王立峰 殷 實(shí) 徐斐然 石嘉懌 鞠興榮

(1. 南京財(cái)經(jīng)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 南京 210023；2. 江蘇省現(xiàn)代糧食流通與安全協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210023；3. 江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇 無錫 214122)

油菜的栽種歷史悠久，中國作為主要的油菜生產(chǎn)國之一，油菜籽產(chǎn)量超過1.40×107t。加工處理后，會產(chǎn)生9.00×106t的菜籽餅粕。菜籽餅粕中不僅含有豐富的多糖、卵磷脂、維生素、微量元素等，還含有高達(dá)35%～42%的蛋白質(zhì)[1]。菜籽蛋白的氨基酸組成合理，與其它植物蛋白相比，幾乎不存在限制氨基酸，具有很好的營養(yǎng)性[2]。以菜籽蛋白為原料，經(jīng)生物酶法可以得到利用率高、易吸收、抗原性低，不會產(chǎn)生過敏反應(yīng)的小分子菜籽多肽[3]，其生物活性受到廣泛關(guān)注。研究表明，菜籽多肽具有抗氧化[4-6]、抑制ACE[7]、抑制腫瘤生長等生物活性[8]，這類研究將促使菜籽多肽在功能性食品市場上有廣闊的前景。

菜籽蛋白在水解制備菜籽多肽的過程中，不僅要用堿液來調(diào)節(jié)蛋白酶的最適pH值，還要通過不斷的增加堿液來維持體系的pH值，導(dǎo)致樣品中混入了大量的無機(jī)鹽。此外，水解液最終色澤呈現(xiàn)黑褐色，干燥后的產(chǎn)品色澤也較深。這些因素使菜籽肽相關(guān)產(chǎn)品在食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域中的應(yīng)用得到限制。目前在實(shí)驗(yàn)室及工業(yè)生產(chǎn)中多肽物質(zhì)的精制通常包括脫色、脫鹽等步驟，常用的脫色方法是活性炭脫色，脫鹽方法是大孔吸附樹脂法[9]。大孔吸附樹脂法，主要是通過分子間疏水相互作用有選擇性地對分子進(jìn)行吸附，不僅能降低其中可溶性成分，保留水解物中的疏水性肽段，而且成本較低、重復(fù)利用性好[10]。

目前針對多肽物質(zhì)的脫鹽工藝研究相對集中在大豆肽及小麥麥胚多肽等[11-12]。對于菜籽多肽的研究較少，而且已有研究基本集中于對分離純化出的單一肽段進(jìn)行鑒定及功能評價，如謝慧慧等[8]從菜籽粕中分離純化出菜籽抗腫瘤肽，并結(jié)合Western Blot分析菜籽抗腫瘤肽對腫瘤細(xì)胞生長及腫瘤細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的影響，初步明確菜籽抗腫瘤肽的作用機(jī)理。針對菜籽肽產(chǎn)品本身的精制研究工藝和產(chǎn)物特性研究還未見報(bào)道。本試驗(yàn)在前期通過酶解菜籽粕制備菜籽多肽的基礎(chǔ)上擬就菜籽多肽的精制工藝中的脫鹽進(jìn)行探討，以期為后續(xù)菜籽多肽的功能性應(yīng)用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

寧雜19號油菜籽粕：江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所；

粉末狀活性炭、凝血酶(12 IU/mL)、脂多糖 (LPS)：化學(xué)純，北京索萊寶科技有限公司；

噻唑藍(lán)(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(FBS)、雙抗(青霉素10 kU/mL，鏈霉素10 mg/mL)：分析純，美國Gibco公司；

NO試劑盒：上海碧云天生物科技有限公司；

RAW264.7巨噬細(xì)胞：上海細(xì)胞庫；

DA201-C大孔吸附樹脂：鄭州勤實(shí)科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

數(shù)顯恒溫水浴鍋：HH-4型，國華電器有限公司；

純水機(jī)：Milli-Q型，美國密理博公司；

臺式冷凍干燥機(jī)：FreeZone 2.5 L型，美國LABCONCO公司；

紫外可見分光光度計(jì)：U-3900型，日本HITACHI公司；

上下?lián)u擺搖床：TY-80B型，南京大學(xué)；

生物安全柜：1300-A型，美國賽默飛世爾科技有限公司；

CO2培養(yǎng)箱：250i型，美國賽默飛世爾科技有限公司；

酶標(biāo)儀：SpectraMax M2e型，美國Molecular Devices公司；

氨基酸分析儀：L-8900型，日本Hittachi公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 菜籽肽粗品制備 根據(jù)實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化的條件，以寧雜19號油菜籽粕(由江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院所提供)為原料，將菜籽餅粕粉碎、脫油后，利用堿提酸沉提取菜籽分離蛋白，通過Alcalase和Flavourzyme分步水解制備菜籽蛋白水解物，Alcalase添加量6 000 IU/g，水解時間3 h；Flavourzyme添加量4 000 IU/g，水解時間2 h，制備得到菜籽肽粗品。

1.3.2 粉末活性炭脫色處理 取一定量菜籽多肽液，根據(jù)本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)化后的條件，采用粉末活性炭脫色?；钚蕴刻砑恿?%，脫色溫度60 ℃，脫色時間60 min，pH 3.5。此時，多肽脫色率為85.41%，回收率為71.54%。將脫色后的菜籽多肽冷凍干燥后于-20 ℃儲藏備用。

1.3.3 DA201-C大孔吸附樹脂精制工藝確定

(1) 樣品濃度的影響：將脫色后的菜籽多肽配置成15，30，45，60，75 mg/mL。然后分別取一定量的菜籽多肽脫色溶液以2 BV/h流速流經(jīng)層析柱，上樣吸附結(jié)束后，用2 BV蒸餾水洗脫，再用50%乙醇解吸，流速與上樣流速一致，洗脫2 BV后停止洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，測定脫鹽率和肽的回收率。取水解液5 mL，加入10%三氯乙酸溶液5 mL，靜置30 min，離心20 min(8 000×g)。取1 mL 上清液加入3 mL雙縮脲溶液(0.75 g無水硫酸銅和3 g酒石酸鉀鈉溶于250 mL 的蒸餾水，在攪拌時加入10%氫氧化鈉溶液150 mL和碘化鉀0.5 g，定容至500 mL)，在25 ℃條件下，靜置30 min 后，在540 nm處測定吸光度。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，對照標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中的蛋白含量(mg/mL)。按式(1)計(jì)算蛋白回收率。

(1)

式中：

c——蛋白回收率，%；

m1——菜籽蛋白水解液中蛋白含量，mg/mL；

m2——菜籽粗蛋白含量，mg/mL。

(2) 流速的影響：取一定量菜籽多肽脫色溶液，分別以1，2，3，4，5 BV/h流速流經(jīng)層析柱，上樣吸附結(jié)束后，用2 BV蒸餾水洗脫，再用50%乙醇解吸，流速與上樣流速一致，洗脫2 BV后停止洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，測定脫鹽率和肽回收率。

(3) pH的影響：取一定量的菜籽多肽脫色溶液，分別調(diào)節(jié)pH為3.5，4.5，5.5，6.5，7.5，然后都以2 BV/h流速流經(jīng)層析柱，上樣吸附結(jié)束后，用2 BV蒸餾水洗脫，再用50%乙醇解吸，流速與上樣流速一致，洗脫2 BV后停止洗脫，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮后，按式(2)、(3)計(jì)算脫鹽率和肽回收率。

(2)

式中：

c——脫鹽率，%；

c1——脫鹽后Cl-濃度，mg/mL；

v1——收集液體積，mL；

c2——脫鹽前Cl-濃度，mg/mL；

v2——上樣體積，mL，

(3)

式中：

c1——肽回收率，%；

m3——脫鹽后樣品多肽含量，mg/mL；

m4——脫鹽前樣品多肽含量，mg/mL。

(4) 解吸劑的影響：不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸試驗(yàn)經(jīng)脫色條件處理，并確定大孔吸附樹脂精制工藝后，在解吸階段分別采用體積分?jǐn)?shù)25%，50%，75%，100%的乙醇解吸，經(jīng)過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)、冷凍干燥后得到4個菜籽肽組分，分別是RP25、RP50、RP75、RP100。按式(4)計(jì)算精制肽回收率。

(4)

式中：

c2——精制肽回收率，%；

m5——凍干后各組分的多肽含量，mg/mL；

m6——解吸前樣品多肽含量，mg/mL。

1.3.4 產(chǎn)物特性測定

(1) 多肽含量：參照文獻(xiàn)[13]。

(2) 含鹽量：參照文獻(xiàn)[14]。

(3) 灰分：按GB/T 5009.4—2003執(zhí)行。

(4) 單寧含量：采用鄰二氮菲—鐵(Ⅲ)分光光度法[15]。稱取一定量的樣品溶于水中，在95 ℃中水浴1 h后，冷卻至室溫，過濾，將濾液移至100 mL容量瓶中并定容。從100 mL容量瓶中取稀釋液1 mL于50 mL容量瓶中，分別加入0.01 mol/L的鐵(Ⅲ)溶液(稱取2.41 g硫酸鐵銨溶于500 mL蒸餾水，并加入0.5 mL濃硫酸) 3 mL，置于80 ℃水浴25 min。冷卻至室溫后依次加入緩沖液(15 g冰醋酸和20 g醋酸鈉溶于250 mL蒸餾水，配成pH 4.4的溶液) 4 mL、0.015 mol/L的鄰二氮菲溶液(取鄰二氮菲1.485 g溶于500 mL蒸餾水)6 mL、0.05 mol/L EDTA溶液(0.25 g EDTA二鈉鹽溶于500 mL 蒸餾水)1 mL，定容至50 mL后搖勻，靜置10 min，在510 nm波長測定OD值。對照單寧標(biāo)準(zhǔn)曲線求得樣品溶液中單寧的含量。

(5) 植酸含量：采用三氯化鐵滴定法[16]。取2 g樣品于50 mL容量瓶，采用鹽酸浸提，離心后取2 mL上清液，稀釋至10 mL。加入10 g/100 mL磺基水楊酸溶液2滴，用三氯化鐵溶液滴定至紫色不褪去。

(6) 硫苷含量：采用氯化鈀法[17]。稱取樣品0.1 g于10 mL 試管中，在沸水浴中干蒸10 min，加入8 mL的沸水，接著在沸水浴中蒸煮40 min，攪拌后，取出來靜置冷卻后，稀釋至10 mL。取0.5 mL過濾后，加入 0.1%羧甲基纖維素鈉2 mL，再加入氯化鈀顯色溶液(稱取177 mg的氯化鈀加入6.2%的鹽酸溶液2 mL和20 mL的蒸餾水，加熱溶解后定容至250 mL)1 mL，然后在24 ℃恒溫箱中放置3 h，在540 nm測OD值。經(jīng)換算得出硫苷含量，并以氯化鈀、羧甲基纖維素鈉空白溶液作為參比溶液。

(7) 產(chǎn)物體外抗血栓活性：酶標(biāo)儀溫度設(shè)置37 ℃，檢測波長405 nm。不同濃度的樣品溶液、凝血酶溶液和纖維蛋白溶液都以0.05 mol/L Tris-HCl和0.12 mmol/L的NaCl混合緩沖溶液配置(pH 7.2)。在96孔板里加入0.1 g/100 mL 纖維蛋白原溶液140 μL和樣品溶液40 μL，混合均勻后在405 nm處讀數(shù)(SB)。加入10 μL的凝血酶溶液(12 IU/mL)，啟動反應(yīng)10 min后，在405 nm 處讀數(shù)(S)。取40 μL的緩沖液代替樣品溶液，重復(fù)上述步驟，讀數(shù)分別是CB和C[18]。樣品凝血酶的抑制率按式(5)計(jì)算：

(5)

式中：

c0——凝血酶的抑制率，%；

C——緩沖液啟動反應(yīng)10 min后在405 nm處OD值；

CB——緩沖液混合均勻后在405 nm處OD值；

S——樣品溶液啟動反應(yīng)10 min后在405 nm處OD值；

SB——樣品溶液緩沖液混合均勻后在405 nm處OD值。

(6)

式中：

c——NO抑制率，%；

c1——只加入LPS(脂多糖)所產(chǎn)生的亞硝酸鹽濃度，μg/mL；

c2——加入不同濃度樣品和LPS(脂多糖)所產(chǎn)生的亞硝酸鹽濃度，μg/mL。

(9) 產(chǎn)物氨基酸組成分析：取0.2 g樣品置于水解管中，加入6 mol/L的鹽酸，真空封口，在110 ℃條件下水解24 h。反應(yīng)結(jié)束后經(jīng)過濾濃縮后采用0.02 mol/mL 的HCl溶液定容至50 mL，再經(jīng)0.22 μm的過濾器過濾后，采用氨基酸分析儀進(jìn)行氨基酸組分的分析。

1.4 數(shù)據(jù)處理

每組試驗(yàn)均重復(fù)3次，結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差。利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析，顯著性水平為P<0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 DA201-C大孔吸附樹脂精制工藝研究

2.1.1 樣品濃度的影響 樣品濃度對脫鹽率和多肽回收率的影響見圖1。由圖1可知，隨著多肽液濃度的升高，多肽回收率呈下降趨勢，當(dāng)多肽液濃度>30 mg/mL時，多肽回收率下降趨勢加劇。多肽液濃度較低時，肽能夠與大孔樹脂充分地接觸，在疏水相互作用下，盡可能多地被吸附。但隨多肽液濃度的降低，生產(chǎn)周期就會延長，圖1 表明，整體上多肽液濃度對脫鹽率沒有明顯影響。綜合考慮，多肽液濃度可選擇30 mg/mL。

圖1 樣品濃度對多肽回收率和脫鹽率的影響Figure 1 Effect of sample concentration on recovery of peptide and desalination rate

2.1.2 流速的影響 流速對脫鹽率和多肽回收率的影響見圖2。由圖2可知，洗脫流速不同對多肽回收率有顯著的影響，洗脫流速1 BV/h時比5 BV/h多肽回收率高出12.02%；而整體來看，流速對脫鹽率顯著性不明顯。因?yàn)橄疵摿魉? BV/h 時比1 BV/h多肽回收率沒有明顯的降低，且流速越快生產(chǎn)周期越短，所以選擇3 BV/h較為合理。

2.1.3 pH的影響 pH對脫鹽率和多肽回收率的影響見圖3。圖3表明，pH對脫鹽率影響不大，而在pH為4.5～5.5時多肽回收率較大，當(dāng)pH為4.5時多肽回收率最大，可能是當(dāng)pH值在蛋白質(zhì)等電點(diǎn)時，蛋白質(zhì)分子所帶凈電荷少，分子間的靜電斥力小，吸引力增強(qiáng)，所以不易被水洗脫，選擇pH 4.5較為合理。

圖2 流速對多肽回收率和脫鹽率的影響Figure 2 Effect of flow rate on recovery of peptide and desalination rate

2.1.4 解吸劑的影響 圖4為不同體積分?jǐn)?shù)乙醇解吸所得的多肽回收率。75%乙醇解吸所得組分的多肽回收率最高(74.40%)。隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加，解吸率增加，但乙醇濃度太高，達(dá)到100%時，肽類物質(zhì)難以溶解，解吸液也出現(xiàn)了渾濁現(xiàn)象[19-20]。解吸時，不同體積分?jǐn)?shù)乙醇的極性不同，導(dǎo)致與不同肽段親和力不一樣，所以以不同體積分?jǐn)?shù)乙醇對菜籽肽進(jìn)行洗脫，可能得到具有不同生物活性的菜籽多肽[21]。

圖3 pH對多肽回收率和脫鹽率的影響Figure 3 Effect of pH on recovery of peptide and desalination rate

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對多肽回收率的影響Figure 4 The effect of different volume fraction of ethanol on peptide recovery

2.2 DA201-C大孔吸附樹脂精制過程中解吸劑濃度對多肽功能特性的影響

不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分的凝血酶抑制率見圖5；不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫組分對LPS刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO的抑制作用見圖6。抑制凝血酶催化形成纖維蛋白能力，即凝血酶抑制率可以用來評價體外抗血栓的能力。由圖5可知，隨著濃度的不斷增加(2.5～20.0 mg/mL)，4個組分(RP25、RP50、RP75、RP100)的凝血酶抑制率也不斷增加，RP25、RP50、RP75、RP100的IC50值分別是16.94，13.13，8.82，9.08 mg/mL，其中RP75的抑制凝血酶催化形成纖維蛋白的能力最強(qiáng)。

本試驗(yàn)中，采用LPS刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO的炎癥模型來評價體外抗炎活性。由圖6可知，RP25、RP50、RP75、RP100在0.1～0.2 mg/mL時，LPS刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生的NO釋放量沒有顯著性差異(P>0.05)，RP25、RP50、RP75、RP100在0.5 mg/mL后，LPS刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7產(chǎn)生的NO釋放量有了顯著性差異(P<0.05)。RP25、RP50、RP75、RP100 抑制LPS刺激誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7 釋放NO的IC50值分別是0.97，1.01，0.80，0.78 mg/mL。結(jié)合2.1.4，精制工藝中解吸時乙醇的體積分?jǐn)?shù)選擇75%較為合理，此時, RP75具有良好的抗血栓活性(IC50=8.82 mg/mL)和抗炎活性 (IC50=0.80 mg/mL)。Zhong等[22]發(fā)現(xiàn)大豆蛋白水解物用DA201-C大孔吸附樹脂處理時，經(jīng)75%乙醇洗脫的組分具有最高的降膽固醇活性；Zhang等[23]研究發(fā)現(xiàn)草魚魚鱗肽經(jīng)80%乙醇洗脫的組分具有最高的ACE抑制活性；Zhang等[24]認(rèn)為RPH55 (DA201-C大孔吸附樹脂純化菜籽蛋白水解液時，經(jīng)55%乙醇洗脫的菜籽肽組分)總抗氧化高于RPH25和RPH85，所以DA201-C大孔吸附樹脂可以用不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇解吸來分離純化肽類以滿足不同功能活性的需求。

不同字母表示差異顯著(P<0.05)圖5 不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇洗脫組分的凝血酶抑制率Figure 5 Thrombin inhibition rate of ethanol elution components of different volume fraction

圖6 不同體積分?jǐn)?shù)乙醇洗脫組分對LPS誘導(dǎo)小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7釋放NO的抑制作用

Figure 6 The inhibitory effect of ethanol elution components of different volume fraction on NO reaease in LPS-stimulated RAW264.7 cells

2.3 菜籽精制多肽(RP75)的基本組成

從表1來看，經(jīng)DA201-C大孔吸附樹脂精制后的菜籽多肽，肽含量高達(dá)74.94%，灰分含量為2.25%，單寧含量為0.60%，而植酸和硫苷均未檢出。菜籽精制多肽(RP75)抗?fàn)I養(yǎng)因子總體含量較低，肽含量較高，無機(jī)物含量較低，基本滿足食用要求。

表1 菜籽精制肽的組成Table 1 Composition of rapeseed refined peptide

2.4 菜籽精制多肽(RP75)的氨基酸組成特性

從表2可以看出，菜籽精制多肽(RP75)是由豐富氨基酸組成的植物蛋白肽。菜籽精制多肽(RP75)中Glu、必需氨基酸、疏水性氨基酸以及帶正電荷氨基酸含量較高，分別占氨基酸總量的16.50%，34.77%，36.10%，14.88%。研究表明，疏水性氨基酸和Glu殘基含量可能在抗血栓活性方面起到了重要的作用[25-26]；帶正電荷的氨基酸和疏水性氨基酸被認(rèn)為在肽的抗炎活性方面起到了作用[27]，由此可以推斷RP75可能具有較好的抗血栓和抗炎活性。

3 結(jié)論

本研究發(fā)現(xiàn)利用DA201-C大孔吸附樹脂精制菜籽肽的最佳工藝條件為多肽濃度30 mg/mL，流速3 BV/h，pH 4.5，乙醇解吸濃度75%。經(jīng)測定利用該方法制得的菜籽精制多肽(RP75)中抗?fàn)I養(yǎng)因子總體含量較低，肽含量較高，有豐富氨基酸，并具有良好的抗血栓活性和抗炎活性。

表2菜籽精制多肽(RP75)的氨基酸組成?

Table 2 Amino acid composition of rapeseed refined peptide g/100 g

? 必需氨基酸(EAA)：Val、Ile、Leu、Met、Thr、Phe、Lys；疏水性氨基酸(HAA)：Met、Phe、Val、Leu、Ile、Pro、Ala；帶正電荷氨基酸(PCAA)：Arg、Lys、His。

但是本研究僅通過成分分析、體外抗血栓及抗炎活性測定進(jìn)行了研究，后續(xù)將在此基礎(chǔ)上通過細(xì)胞試驗(yàn)及分子生物學(xué)評價手段對菜籽多肽的功能特性和作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探究，以期為其功能性應(yīng)用提供理論依據(jù)。