李 梁 唐書澤 楊盼盼 劉倩妤 吳事正

(暨南大學食品科學與工程系，廣東 廣州 510632)

飲用水安全對居民生命健康至關重要，從飲用水供應處到食品企業(yè)和居民區(qū)經(jīng)歷的環(huán)節(jié)復雜[1]，存在人為投毒和突發(fā)性污染的安全隱患[2]。國家對化工污染物和農(nóng)藥等有毒有害試劑有很嚴格的管制措施[3]，但是由天然動植物毒素造成的人為投毒和突發(fā)污染易被忽視[4]。

谷物如稻谷、麥粒、玉米等在潮濕的環(huán)境下極易發(fā)霉，其中的赭曲霉在生長的過程中容易產(chǎn)生和積累赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA)，該毒素一旦進入人體，將嚴重危害人體健康和生命。赭曲霉毒素A可嚴重損害人的肝腎[5]，致畸致癌，并且可經(jīng)血液轉入母乳，直接危害嬰兒生命健康[6-7]。OTA分布廣、毒性強，對狗和豬的口服LD50分別為0.2，1.0 mg/kg[8-9]。OTA因其方便獲得和富集，容易被不法分子利用在飲用水供應系統(tǒng)中人為投毒，有可能導致大面積中毒等應急事件。

OTA的檢測方法主要有高效液相質(zhì)譜串聯(lián)法[10]、薄層色譜法[11]、化學發(fā)光酶聯(lián)免疫分析法[12]、納米金核酸適配體法[13]、金標記羥胺放大化學發(fā)光法[14]等。這些方法存在設備維護昂貴、分析周期長、前處理繁瑣、納米金檢測成本高、酶與適配體競爭性反應易受pH、溫度等環(huán)境因素影響及難以對飲用水中OTA實現(xiàn)在線監(jiān)測等缺點。流動注射化學發(fā)光法靈敏度高、成本低廉、易操作且可連續(xù)進樣實現(xiàn)快速在線檢測[15]，已應用于食品檢測[16]、環(huán)境監(jiān)測[17]和臨床分析[18]等領域。本課題組前期已針對飲用水中黃綠青霉素[19]、棒曲霉素[20]等毒素開發(fā)了流動注射化學發(fā)光的快速檢測方法，但由于毒素結構的差異，檢測的化學發(fā)光體系也不盡相同。前期預試驗表明，OTA對魯米諾—高碘酸鈉發(fā)光體系有抑制作用，但信號很弱，難以檢測。本研究擬利用光信號增敏劑，建立流動注射化學發(fā)光新方法用于快速在線監(jiān)測飲用水中OTA突發(fā)性污染。

1 材料與方法

1.1 主要設備與試劑

1.1.1 主要儀器設備

微弱發(fā)光測量儀：BPCL-K型，北京亞泊斯科技有限公司；

六通轉換進樣閥：CHEMINERT C22Z-3186型，美國VICI公司；

蠕動泵：BT100-1F型，保定蘭格恒流泵有限公司；

紫外可見分光光度計：UV-3600 Plus型，日本SHIMADZU公司。

1.1.2 主要試劑

赭曲霉毒素A標準品：純度>99.0%，美國Sigma公司；

魯米諾、吐溫20：分析純，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 進樣方法 如圖1所示，a、b、c、d管路分別泵入魯米諾、樣品、高碘酸鈉和吐溫20溶液，四通道于六通閥混合，混合溶液進入化學發(fā)光流通池中反應產(chǎn)生熒光。流通池中的光信號由光電倍增管PMT放大、檢測，再轉化為電信號由計算機分析和記錄，最終以峰型圖呈現(xiàn)。

a. 魯米諾溶液 b. 樣品溶液 c. 高碘酸鈉溶液 d. 吐溫20溶液 P. 蠕動泵 V. 六通轉換進樣閥 W. 廢液池 F. 化學發(fā)光流通池 NHV. 負高壓 PMT. 光電倍增管 PC. 電腦記錄儀

圖1 流動注射化學發(fā)光流程圖

Figure 1 Schematic diagram of flow-injection CL system

1.2.2 化學發(fā)光動力學特征曲線 以吐溫20為增敏劑，基于OTA對魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20發(fā)光體系的抑制作用，通過對比加入吐溫20和OTA體系前后化學發(fā)光強度的變化，繪制化學發(fā)光動力學特征曲線。

1.2.3 增敏劑最適濃度選擇 為探究增敏劑吐溫20最適濃度，在氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，魯米諾濃濃度6×10-4mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL 時，考察吐溫20濃度(10，20，30，40，50，60，70 mg/L)對體系化學發(fā)光強度的影響。

1.2.4 單因素試驗 為探究反應條件中各因素對體系化學發(fā)光強度的作用，單因素試驗依次考察氫氧化鈉、魯米諾、高碘酸鈉溶液濃度對體系化學發(fā)光強度的影響。

(1) 氫氧化鈉濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，魯米諾濃度6×10-4mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時，考察氫氧化鈉濃度(0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30，0.35 mol/L)對體系化學發(fā)光強度的影響。

(2) 魯米諾濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，高碘酸鈉濃度5×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時，考察魯米諾濃度(1×10-4，2×10-4，4×10-4，6×10-4，8×10-4，1×10-3，1.2×10-3mol/L)對體系化學發(fā)光強度的影響。

(3) 高碘酸鈉濃度選擇：在吐溫20濃度40 mg/L，氫氧化鈉濃度0.2 mol/L，魯米諾濃度6×10-4mol/L，OTA濃度0.006 μg/mL時，考察高碘酸鈉濃度(5×10-5，1×10-4，3×10-4，5×10-4，7×10-4，9×10-4，1.1×10-3mol/L)對體系化學發(fā)光強度的影響。

1.2.5 響應面試驗設計 根據(jù)單因素試驗，采用三因素三水平的響應面試驗探討反應條件氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、高碘酸鈉濃度之間可能存在的交互作用，并對試驗條件進行優(yōu)化。

1.2.6 共存物干擾試驗 城市飲用水中常見的無機離子和金屬離子等可能會對OTA的測定有一定干擾作用，在最佳試驗條件下，OTA濃度0.006 μg/mL，允許干擾誤差±5%時，考察可能的共存物和常見離子對測定結果的影響。

1.2.7 標準曲線、檢測限、精密度及加標回收測定 在最優(yōu)試驗條件下，考察OTA濃度為0.006～1.000 μg/mL時體系化學發(fā)光強度的變化，繪制標準曲線，計算檢測限和精密度。分別測定宿舍飲用水、怡寶水、鼎湖山泉水中OTA的含量，并以0.05，0.50 μg/mL OTA進行加標回收測定。

1.2.8 反應機理探討 紫外可見分光光度計分別對吐溫20溶液、OTA溶液、魯米諾—高碘酸鈉溶液、魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20溶液、魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20—OTA混合溶液在200～500 nm波長范圍內(nèi)進行紫外吸收光譜掃描。

2 結果與分析

2.1 化學發(fā)光動力學特征曲線

如圖2所示，對比曲線a、c，說明吐溫20可作為敏化劑，使魯米諾—高碘酸鈉發(fā)光體系的化學發(fā)光強度顯著增加。分析曲線b、c，說明OTA對魯米諾—高碘酸鈉—吐溫20發(fā)光體系有抑制作用，因此選擇該發(fā)光體系對OTA進行快速檢測。

2.2 增敏劑最適濃度選擇

隨著吐溫20濃度的增加，體系的化學發(fā)光強度增強(圖3)。當吐溫20濃度為40 mg/L時，體系的化學發(fā)光強度較大，此時峰形很好，基線穩(wěn)定，當吐溫20濃度繼續(xù)增大時，峰形的穩(wěn)定性變差，基線有一定的波動，綜合考慮最佳信噪比、試劑消耗、峰形及平臺區(qū)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性等因素，選擇最佳吐溫20濃度為40 mg/L。

圖2 化學發(fā)光體系動力學特征曲線Figure 2 Kinetic characteristics curve for CL system

圖3 吐溫20濃度對發(fā)光強度的影響Figure 3 The effect of Tween 20 concentration on chemiluminescence intensity

2.3 單因素試驗

2.3.1 氫氧化鈉濃度 氫氧化鈉濃度會直接影響魯米諾的氧化光反應。如圖4所示，當氫氧化鈉濃度為0.20 mol/L 時，體系的發(fā)光強度達到最大且較穩(wěn)定，過高的氫氧化鈉濃度反而會抑制發(fā)光強度，可能堿性過強會影響氧化劑的電極電位和氧化能力[21]，從而降低發(fā)光強度，因此選取氫氧化鈉濃度0.20 mol/L。

2.3.2 魯米諾濃度 魯米諾作為發(fā)光劑會直接影響體系的化學發(fā)光強度。如圖5所示，體系的化學發(fā)光強度隨魯米諾濃度的增加而增強，而魯米諾濃度高于6×10-4mol/L 時，體系的化學發(fā)光強度增長較為緩慢，考慮試劑的消耗和環(huán)保等因素，最終選取魯米諾的濃度為6×10-4mol/L。

2.3.3 高碘酸鈉濃度 高碘酸鈉作為發(fā)光體系的氧化劑，其濃度的高低會顯著影響體系的化學發(fā)光強度。由圖6可知，體系的化學發(fā)光強度先隨高碘酸鈉濃度的增大而增強，當高碘酸鈉濃度為5×10-4mol/L時體系的發(fā)光強度達到最大，隨著濃度繼續(xù)增大，體系發(fā)光強度反而緩慢降低，因此選取高碘酸鈉濃度為5×10-4mol/L。

圖4 氫氧化鈉的濃度對發(fā)光強度的影響Figure 4 The effect of sodium hydroxide concentration on chemiluminescence intensity

圖5 魯米諾濃度對發(fā)光強度的影響Figure 5 The effect of luminol concentration on chemiluminescence intensity

圖6 高碘酸鈉濃度對發(fā)光強度的影響Figure 6 The effect of sodium periodate concentration on chemiluminescence intensity

2.4 響應面試驗

2.4.1 試驗設計方案及結果 綜合單因素試驗結果，在最佳增敏劑濃度時，根據(jù)Box-Behnken中心組合設計原理，以體系化學發(fā)光強度為響應值，設計了三因素三水平的響應面優(yōu)化試驗。因素和水平見表1，試驗方案及結果見表2，響應面回歸模型方差分析結果見表3。

表1 響應面試驗因素與水平Table 1 Response surface experimental factors and levels mol/L

表2 Box-Behnken試驗方案和結果Table 2 Box-Behnken design and experimental results

表3 響應面回歸模型方差分析?Table 3 Analysis for response surface regression model

? *表示差異顯著，P<0.05；**表示差異極顯著，P<0.01。

2.4.2 模型擬合和顯著性檢驗 各因素經(jīng)回歸擬合后，體系化學發(fā)光強度對氫氧化鈉濃度、魯米諾濃度、高碘酸鈉濃度的多元二次回歸擬合方程如下：

Y=42 553.00+6 267.75A+2 423.25B+928.50C+1 950.50AB+148.50AC-126.00BC-15 830.50A2-8 240.00B2-5 731.50C2。

(1)

由表3可知，模型顯著水平P值<0.000 1，說明模型的擬合效果很好，可準確描述各變量與響應值之間的關系。模型決定系數(shù)R2=0.997 0，表明預測結果和響應值結果有很好的一致性，模型校正系數(shù)RAd j=0.993 0，表示試驗結果有99.30%受試驗各變量的影響，說明該模型可用于分析和預測響應值結果。比較各變量對響應值的影響可知，C項為顯著水平，A、B、A2、B2、C2和AB交互項均為極顯著水平，說明回歸模型中各因素不是簡單的線性關系，存在一定的交互作用，其交互作用通過3D圖和二維等高線圖可直觀看出，如圖7 所示。

2.4.3 響應面最優(yōu)條件預測和驗證 結合響應面模型優(yōu)化和分析預測功能，得到體系檢測最佳條件為：吐溫20濃度40 mg/L、氫氧化鈉濃度0.21 mol/L、魯米諾濃度6.34×10-4mol/L、高碘酸鈉濃度5.16×10-4mol/L，此時體系化學發(fā)光強度為43 453?？紤]實際操作的方便，將最佳檢測條件修正為：吐溫20濃度40 mg/L、氫氧化鈉濃度0.20 mol/L、魯米諾濃度6.0×10-4mol/L、高碘酸鈉濃度5.0×10-4mol/L。在此條件下進行3次平行測定，實際體系的化學發(fā)光強度為42 596，與預測值偏差1.97%，說明響應面優(yōu)化條件真實可靠。

2.5 共存物干擾試驗

2.6 標準曲線、檢測限、精密度及加標回收測定

在最佳條件下，對不同濃度的OTA進行梯度試驗，試驗表明，體系的化學發(fā)光強度(y)與OTA濃度(x)在0.006～1.000 μg/mL 時有良好的線性關系，線性方程為y=-3 101.5x+42 120，相關系數(shù)R2=0.993 1。對濃度0.2 μg/mL OTA平行測定11次，計算得到相對偏差為1.68%，說明儀器精密度良好。按照IUPAC組織的規(guī)定，以3倍的標準偏差計算方法的檢測限為1.74×10-3μg/mL。在最優(yōu)檢測條件下，分別對宿舍飲用水、怡寶水、鼎湖山泉水進行加標回收測定，結果見表4，經(jīng)計算加標回收率為80.6%～92.4%。

2.7 反應機理探討

表4 不同水樣中赭曲霉毒素A的加標回收測定結果Table 4 Obtained results for the determination of OTA in water samples(n=3)

圖7 三因素交互作用的3D圖和等高線圖Figure 7 Three dimensional response surface and contour plots for the interaction of three factors

圖8 紫外—可見吸收光譜圖Figure 8 UV-Vis absorption spectrum of CL system

3 結論

本試驗建立了流動注射化學發(fā)光快速在線監(jiān)測飲用水中OTA的新方法，方法的線性范圍為0.006～1.000 μg/mL，檢出限為1.74×10-3μg/mL(S/N=3)，加標回收率為80.6%～92.4%。本法成本低、靈敏度高、可實時在線監(jiān)測，適用于飲用水中OTA突發(fā)性污染的快速應急預警。但目前的研究主要針對單一毒素，對于混合毒素可考慮化學發(fā)光儀等設備的串聯(lián)進行多毒素的同時在線監(jiān)測，并結合核磁共振、液相質(zhì)譜等方法對毒素的結構作更深入分析。