成 煥 王遠亮，2

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學食品科學技術(shù)學院，湖南 長沙 410128；2. 食品科學與生物技術(shù)湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128)

檳榔是一種藥食同源的植物，在西漢年間傳入中國，有上百年的藥用歷史，與益智仁、砂仁、巴戟天并稱為中國四大南藥，主要成分為檳榔堿、多酚、脂肪、氨基酸、檳榔紅色素等[1]。但近20多年來對檳榔的爭議越來越大，尤其是2003年被認定為一級致癌物后，檳榔被推到了風口浪尖，現(xiàn)階段研究中明晰的主要是檳榔堿的生理功效，對其他成分的研究報道相對較少[2-3]。另外人體中微生物的數(shù)量占人體總細胞數(shù)量的90%左右，其中腸道菌群數(shù)量最多，對人體的影響最為明顯[4]。這些數(shù)量龐大的腸道菌群大致可以分為有益菌、中性菌及有害菌三類，它們通過一定的比例進行組合，相互制約，相互依存[5]。人體腸道菌群還能編碼超過330萬個基因，并在人體營養(yǎng)物質(zhì)代謝、自身發(fā)育、免疫及疾病等方面發(fā)揮作用[6]，外腸道微生物已成為人們研究膳食因子營養(yǎng)功效機制普遍采用的載體。Rycroft等[7]采用腸道菌群體外發(fā)酵模式對益生菌寡糖的性質(zhì)進行評價，與腸道內(nèi)發(fā)酵的結(jié)果相比，兩者在細菌豐度、組成和代謝產(chǎn)物等方面都相似。

本試驗擬以腸道微生物為載體，采用間歇式靜態(tài)厭氧體外發(fā)酵技術(shù)，探究檳榔籽多酚對腸道菌群的作用效果。將健康青年男性糞便作為體外發(fā)酵菌源，以對照組(C組)、添加了純度為74.09%的檳榔籽多酚的試驗組(P組)分別在體外發(fā)酵2，6，12，24 h，分析多酚物質(zhì)的成分變化，發(fā)酵環(huán)境的pH值，腸道微生物多樣性、菌群相對組成和生態(tài)關(guān)系等。旨在為探討鮮檳榔籽中多酚物質(zhì)調(diào)控腸道微生物提供基礎(chǔ)研究，為檳榔藥用研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

檳榔籽多酚：通過有機溶劑提取和大孔樹脂分離，以沒食子酸為標品測得純度為74.09%的多酚提取粉末；

糞便樣品：選擇年齡均在24歲且飲食習慣相近的健康男性3名，要求志愿者2個月內(nèi)未服用抗生素，且無腸道病史，于早飯前采集3名志愿者的糞便樣品；

沒食子酸(GA)標準品：純度≥98.5%，上海瑞永生物科技有限公司；

表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、表沒食子兒茶素(EGC)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)、表兒茶素(EC)、兒茶素(DL-C)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)：標準品，美國Sigma公司；

短鏈脂肪酸標準溶液：乙酸、丙酸、丁酸、異丁酸、戊酸和異戊酸，美國Sigma公司；

試驗用水均為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外—可見分光光度計：WFJ7200型，北京萊伯泰科儀器有限公司；

厭氧操作臺：YQX-II型，上海躍進醫(yī)療器械廠；

厭氧培養(yǎng)箱：BASICI型，重慶江雪科技有限公司

高效液相色譜儀：1200型，安捷倫科技有限公司；

氣相色譜儀：7890A型，安捷倫科技有限公司；

PCR熱循環(huán)儀：GeneAmp?PCR System 9700系列，美國愛普拜斯公司；

臺式冷凍離心機：TGL20型，長沙英泰儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 糞便處理 收集志愿者新鮮全便，各稱取4 g加入36 mL 經(jīng)脫氧處理的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7.4)進行混合，旋渦振蕩3 min，配成糞便懸液，用紗布過濾，備用。

1.3.2 檳榔籽多酚體外發(fā)酵 參考并改進吳根梁等[8]體外發(fā)酵的方法，研究檳榔籽多酚對人體腸道微生物的影響。37 ℃ 條件下，模擬人體腸道厭氧環(huán)境，在發(fā)酵液中加入菌源進行靜態(tài)培養(yǎng)，監(jiān)測各發(fā)酵階段(2，6，12，24 h)短鏈脂肪酸、pH值和微生物指標的變化。

基礎(chǔ)發(fā)酵液1 L配方(pH值7.0)：蛋白胨2 g，酵母提取粉2 g，NaCl 0.1 g，K2HPO40.04 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，CaCl2·2H2O 0.01 g，NaHCO32 g，氯化血紅素0.05 g，L-半胱氨酸0.5 g，豬膽汁酸鹽0.5 g，Tween-80 2 mL，維生素K110 μL。將多酚提取粉末溶于培養(yǎng)基中，添加10%的菌懸液，此時多酚濃度為1 g/100 mL，搖勻后置于37 ℃厭氧培養(yǎng)箱發(fā)酵，所有試驗進行3次重復。

1.3.3 主要兒茶素單體含量測定 高效液相色譜檢測條件：規(guī)格為4.6 mm×250 mm×5 μm 的 Calesil-C18液相色譜柱；柱溫為35 ℃；檢測波長為278 nm；進樣量為10 μL；流速為1.0 mL/min。試驗采用梯度洗脫，流動相A為超純水，流動相B為體積比為40∶2∶1.5 的N，N-2甲基甲酰胺：甲醇：冰醋酸的混合液，洗脫時間及流動相變化情況為：0.01 min，80% A+20% B；15 min，72% A+28% B；28 min，60% A+40% B；32 min，60% A+40% B；35 min，80% A+20% B；40 min，80% A+20% B。用外標法計算各種成分的含量

1.3.4 pH值的測定 用pH計直接測定。

1.3.5 短鏈脂肪酸的含量測定 參考耿梅梅等[9]的方法，用DB-FFAP氣相色譜柱(60 m×0.25 mm×0.25 μm)，流速0.8 mL/min；進樣量1 μL，分流比50∶1，程序升溫：初始溫度60 ℃，維持2 min，以20 ℃/min升至220 ℃，保持3.5 min； 氫火焰離子化檢測器，溫度250 ℃，

1.3.6 Ion S5 XL 平臺擴增子測序分析

(1) 樣本DNA提取及PCR擴增：采用SDS方法提取樣本的基因組 DNA，然后用瓊脂糖凝膠電泳檢測 DNA 的純度和濃度。以檢測達標的基因組DNA為模板，對樣品的16S rDNA V3+V4區(qū)域進行擴增：341F(5′-CCTAYGGGRBGCASCAG-3′)，806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)，使用帶 Barcode 的特異引物擴增得到相應的產(chǎn)物

(2) PCR 產(chǎn)物的混樣和純化：根據(jù) PCR 產(chǎn)物濃度進行等質(zhì)量混樣，待充分混勻后用 1×TAE 濃度 2%的瓊脂糖膠電泳純化，剪切回收目標條帶。

(3) 文庫構(gòu)建與測序：文庫構(gòu)建使用美國Thermofisher 公司的 Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns 建庫試劑盒，然后用Qubit定量儀進行定量和文庫合格檢測，最后用Thermofisher公司的IonS5TMXL測序儀進行測序。

1.4 數(shù)據(jù)分析

1.4.2 Ion S5 XL 平臺擴增子測序數(shù)據(jù)分析 對單端測序得到的原始數(shù)據(jù)進行質(zhì)控、過濾、去嵌合體，得到有效數(shù)據(jù)[10]，然后利用Uparse軟件對序列進行聚類和物種注釋[11]，運用Qiime[12]和Usearch[13]軟件進行樣品復雜度分析，運用R[13]軟件進行統(tǒng)計和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 檳榔籽多酚利用情況

由圖1可以看出，2組中的多酚含量具有顯著差異，變化趨勢也不相同，C組中多酚含量為上升趨勢，在24 h時達到最高，與2 h相比增加了477.07 μg/mL；P組則為下降趨勢，2～6 h為多酚的主要利用階段，期間減少549.47 μg/mL，利用率為18.26%。組間對比可知，不同時間段P組中多酚含量均比C組高出1個數(shù)量級以上。由數(shù)據(jù)分析可知，2組的多酚含量具有顯著性差異，在酚類物質(zhì)充足的條件下，腸道微生物會在前期就利用酚類物質(zhì)；在酚類物質(zhì)缺乏的條件下，腸道微生物可利用環(huán)境中的營養(yǎng)物質(zhì)轉(zhuǎn)化生成酚類物質(zhì)。

試驗還測定了生理功能比較豐富的一類酚類物質(zhì)——兒茶素類。在本樣品中兒茶素類占總酚含量的10%左右。由表1可知，在6 h時C組檢測到少量的各類主要的兒茶素，說明腸道微生物在體外可將非其他物質(zhì)轉(zhuǎn)化成小分子酚類物質(zhì)，供自身利用，但在12 h 時卻無法檢出，可知GA、EGC、DL-C、EC和EGCG被全部利用。P組中兒茶素的總體變化趨勢是先增多后減少，24 h發(fā)酵液中多酚濃度較2 h增加了84 μg/mL，與C組一致。比較單體的變化趨勢可發(fā)現(xiàn)，GA和EGC的變化趨勢相似，DL-C、EC和EGCG的變化趨勢相似；且前兩者均在6 h陡增，后三者含量在6 h處大幅減少，推測腸道微生物中的一種或多種菌在它們的相互轉(zhuǎn)化過程中起到了關(guān)鍵作用，與Schantz等[14]研究的綠茶中的EGCG在小腸中可分解為GA和EGC的結(jié)果相符。分析圖1可知，在酚類物質(zhì)充足的條件下，腸道微生物會在前期利用酚類物質(zhì)，本試驗中檳榔籽多酚添加量為10 mg/mL時，培養(yǎng)6 h后的利用率為18.26%，茶多酚的吸收在小腸部位不受其質(zhì)量濃度的影響[15]，但在大腸處是否受其質(zhì)量濃度的影響還有待研究。

不同小寫字母表示不同時間點同組內(nèi)Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；不同大寫字母表示同一時間點不同組中Duncan檢驗差異顯著，P<0.05

圖1 檳榔籽多酚的含量變化

Figure 1 Changes of the content of areca polyphenols

2.2 發(fā)酵液中pH值的變化

C、P組的起始pH值相近都在9左右，但微生物的生長會影響pH值，檢測發(fā)酵過程各階段各發(fā)酵液的pH值，如圖2 所示。

由圖2可知，在24 h內(nèi)C、P組的pH值均持續(xù)下降，變化趨勢相似。在2 h時2組的pH差別最大，C組比P組高0.43；2～6 h時減幅最大，C組由9.17下降到7.78，P組由8.74下降到7.88；12 h時2組又回到同一水平；繼續(xù)發(fā)酵到24 h，pH均小幅下降，C組減幅大于P組。數(shù)據(jù)表明檳榔籽多酚可以使pH在短時間內(nèi)快速降低，但不影響24 h內(nèi)的變化趨勢。

2.3 短鏈脂肪酸含量的變化

短鏈脂肪酸是人體腸道菌群的發(fā)酵產(chǎn)物，即可以作為腸道黏膜細胞的主要能量來源，還能減少促炎癥因子的產(chǎn)生，降低腸道炎癥[16]、癌癥[17]的發(fā)生。如表2所示，糞菌中微生物在24 h的體外培養(yǎng)中，2組變化趨勢基本一致，C組中的SCFAs含量顯著高于P組。以上6種短鏈脂肪酸的產(chǎn)生情況如下：其中乙酸和丙酸基本為線性增長，丁酸和異戊酸含量的增加主要在12～24 h，增量為乙酸>丙酸>丁酸>異戊酸。在培養(yǎng)24 h后，C組中乙酸、丙酸、丁酸和異戊酸分別提高了6.99，7.74，1.59，2.87倍；P組則分別提高4.51，5.42，1.75，1.35倍；C組比P組明顯提高了1.19，1.25，0.91，2.33倍。異丁酸在C組中呈小幅增加，P組前12 h則呈小幅下降，12～24 h時回升，但仍略低于起始量。戊酸在2組中變化均不明顯。以上數(shù)據(jù)表明，檳榔籽多酚不影響SCFAs的變化趨勢，但會減弱乙酸、丙酸、丁酸、異戊酸的增幅，抑制其在發(fā)酵過程中的積累。比較菌群和SCFAs變化趨勢發(fā)現(xiàn)，Parabacteroides和異戊酸含量變化趨勢一致；Bacteroides、Bilophila與丁酸含量變化趨勢相似，這些菌群和特定短鏈脂肪酸的代謝是否有關(guān)，以及作用機制還需要進一步研究。

表1 檳榔籽多酚中兒茶素類物質(zhì)的含量變化?Table 1 Changes of the content of areca seed polyphenols and its main components μg/mL

? 不同小寫字母表示不同時間點同組內(nèi)Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；不同大寫字母表示同一時間點不同組中Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；數(shù)值為0表示未檢出。

不同小寫字母表示不同時間點同組內(nèi)Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；不同大寫字母表示同一時間點不同組中Duncan檢驗差異顯著，P<0.05

圖2 各發(fā)酵時間段pH值變化圖
Figure 2 pH values for each fermentation period

表2 短鏈脂肪酸(SCFAs)的含量變化?Table 2 Changes of the content of SCFAs μg/mL

? 不同小寫字母表示不同時間點同組內(nèi)Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；不同大寫字母表示同一時間點不同組中Duncan檢驗差異顯著，P<0.05；數(shù)值為0表示未檢出。

2.4 發(fā)酵過程中微生物多樣性分析

膳食是影響腸道微生物生長的重要因素，檳榔籽多酚通過體外發(fā)酵會引起人體腸道微生物變化。

2.4.1 門水平上腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化 為了確定微生物的變化是否主要由檳榔籽多酚引起，對樣品在門水平上進行聚類分析(Unweighted Pair-group Method with Arithmetic Mean，UPGMA)，如圖3所示C組的4個時間點聚在一起，P組的4個時間點也聚在一起，說明檳榔籽多酚的加入使2組產(chǎn)生了差異，并且組間差異大于組內(nèi)差異。利用主成分分析進行驗證，也得到了相同結(jié)果，可以得出后續(xù)微生物變化主要是由檳榔籽多酚加入引起的。

由圖3中還可以看出，放線菌門(Actinobacteria)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)是它們共同的優(yōu)勢微生物。以時間為序，厚壁菌門在2組內(nèi)的變化趨勢一致，菌群豐度先增加后減少，P組變化幅度大于C組。

2.4.2 屬水平上腸道菌群的結(jié)構(gòu)變化 為找出屬水平下各樣本中的優(yōu)勢物種，選取豐度排名前35的屬，根據(jù)其在每個樣品中的豐度信息，從物種和樣品兩個層面進行聚類。如圖4 所示，這35個屬的細菌分屬于6個優(yōu)勢的細菌門：19個厚壁菌門(Frmicutes)類細菌，8個變形菌門(Proteobacteria)類細菌，3個擬桿菌門(Bacteroidetes)類細菌，3個放線菌門(Actinobacteria)類細菌，1個擬桿菌門(Fusobacteria)類細菌，1個疣微菌門(Verrucomicrobia)類細菌。聚類分析結(jié)果顯示，體外培養(yǎng)試驗中C、P組的優(yōu)勢菌存在明顯差異。檳榔籽多酚使腸道菌群中21個菌屬相對豐度變化明顯。

選取在屬水平上相豐度排名前10的微生物進行比較，Others表示圖中這10個屬之外的其他所有屬的相對豐度之和。如圖5所示，P組中柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)、擬桿菌屬(Bacteroides)和Blautia高于C組，檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)和Parabacteroides的豐度顯著低于C組。在P組中柔嫩梭菌屬豐度由0.72%增加到31.79%，柔嫩梭菌類群是一種人體腸道菌群的共生菌，其很多成員具有重要的生理功能，如降解膳食纖維產(chǎn)生丁酸鹽，高脂小鼠口服柔嫩梭菌群可減少脂肪組織炎癥，增加腸道完整性[18]。擬桿菌屬(Bacteroides)由相對豐度4.49% 增加到18.91%，雙歧桿菌屬(Bifidobacterium)也有小幅增加Blautia中的Ruminococcus_sp_5_1_39BFAA豐度由1.90%增加到8.19%。屬水平上2組中的優(yōu)勢菌存在差異，C組中主要優(yōu)勢菌為檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。對以上數(shù)據(jù)分析可知，檳榔籽多酚與已經(jīng)報道的植物多酚功效并不完全一致，在短期發(fā)酵過程中可以增加物種豐度，但不會促進腸道中SCFAs的積累。

另外在屬水平相對豐度排名前30的菌群中發(fā)現(xiàn)薩特氏菌(Sutterella)屬在P組中相對豐度高于C組，并在12～24 h 時呈直線增加，LU等[19]在利用林可霉素建立致腹瀉的小鼠模型時也發(fā)現(xiàn)，薩特氏菌在腹瀉小鼠中的豐度明顯比正常小鼠高，止瀉后體內(nèi)薩特氏菌屬數(shù)量明顯下降，薩特氏菌屬很可能是檳榔過量食用引起腹瀉的一類微生物。

圖3 基于Weighted Unifrac距離的UPGMA聚類樹Figure 3 UPGMA Cluster analysis diagram based on UniFrac distance matrix

圖4 屬水平上腸道菌群變化圖(Heatmap 圖)Figure 4 Changes in intestinal microflora of genus level(Heatmap)

圖5 屬水平上的物種相對豐度柱形圖Figure 5 Histogram of relative abundance of species at genus level

3 結(jié)論

本試驗從腸道微生物的角度發(fā)現(xiàn)高濃度檳榔籽多酚對腸道環(huán)境和腸道菌群的影響是多面的，檳榔籽多酚的加入對發(fā)酵環(huán)境的pH變化趨勢無影響，但會在發(fā)酵的2～6 h時減緩環(huán)境中的pH降低，這可能是通過減緩短鏈脂肪酸的積累實現(xiàn)。同時檳榔籽多酚對腸道菌群的改變非常明顯，尤其是高濃度條件下，腸道中的優(yōu)勢菌群會迅速發(fā)生改變，24 h內(nèi)保持發(fā)酵環(huán)境中檳榔籽多酚的高濃度狀態(tài)可防止菌群的自我恢復，并使柔嫩梭菌屬(Faecalibacterium)一直處于優(yōu)勢狀態(tài)。檳榔籽多酚對腸道菌群的影響與其他植物多酚相比存在差異，后續(xù)試驗中會加大樣本量，增加濃度變化來協(xié)助闡明這種變化產(chǎn)生的原因。