王鵬杰，岳川，陳笛，鄭玉成，鄭知臨，林浥，楊江帆，葉乃興

（福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院/茶學(xué)福建省高校重點實驗室，福州 350002）

茶樹[Camellia sinensis(L.)O.Ktunze]作為一種多年生常綠木本植物，是我國南方最重要的經(jīng)濟作物之一，茶葉的優(yōu)質(zhì)、高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)與茶樹品種、栽培環(huán)境及栽培措施密切相關(guān)。茶樹喜溫怕寒，其生長及茶葉加工生產(chǎn)易受多種自然災(zāi)害制約[1]。

植物WRKY基因家族是一類對生長發(fā)育及逆境脅迫響應(yīng)有著重要作用的轉(zhuǎn)錄因子家族[2]，每個家族成員均含有1個或2個由60個氨基酸組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，N端具有高度保守的WRKYGQK核心基序，該序列的氨基酸突變會導(dǎo)致DNA結(jié)合活性的顯著減弱；而C端通常為一段鋅指結(jié)構(gòu)C2H2（C-X4-5-C-X22-23-H-X-H）或C2HC（C-X7-C-X23-H-X-C）。WRKY轉(zhuǎn)錄因子通過特異性結(jié)合靶基因啟動子區(qū)域的W-box元件以調(diào)節(jié)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[3]。自1994年ISHIGURO等首次從甘薯中克隆得到第1個WRKY轉(zhuǎn)錄因子SPF1[4]以來，研究者已相繼在煙草[5]、楊樹[6]、擬南芥[7]、棉花[8]等植物上鑒定得到WRKY轉(zhuǎn)錄因子。近年來，隨著部分植物基因組數(shù)據(jù)的公布，發(fā)現(xiàn)擬南芥WRKY基因家族至少有74個成員[9]，番茄有81個[10]，楊樹有104個[11]，蘋果有132個[12]。已有大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子產(chǎn)物作為正調(diào)控或者負(fù)調(diào)控蛋白參與多種生物及非生物脅迫的響應(yīng)調(diào)節(jié)[13-14]；此外，還作為重要調(diào)節(jié)因子參與植物胚胎發(fā)育、種子萌發(fā)、葉片衰老、生物合成途徑及激素信號傳導(dǎo)等生理發(fā)育過程[15-17]。例如轉(zhuǎn)白菜BcWRKY46基因的煙草對低溫、鹽害及滲透脅迫的敏感性降低[18]；AtWRKY18和AtWRKY60作為正調(diào)控因子參與脫落酸（abscisic acid,ABA）信號途徑，抑制擬南芥種子萌發(fā)、根生長及對鹽脅迫和滲透脅迫的敏感性[7]；青蒿中的AaWRKY1可與倍半萜合酶紫穗槐-4，11-二烯合酶基因（amorpha-4,11-diene synthase,ADS）啟動子區(qū)域中的W-box元件結(jié)合，從而激活A(yù)DS基因表達來促進青蒿素的生物合成[19]；辣椒CaWRKY40可通過介導(dǎo)水楊酸（salicylic acid,SA）、茉 莉 酸（jasmonic acid,JA）、乙 烯（ethylene,ETH）信號途徑來防御青枯病的入侵，并提高植株的耐熱性[20]。

目前,對茶樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的研究較少，美國國立生物技術(shù)信息中心（National Center for Biotechnology Information,NCBI）上 僅 公 布 了CsWRKY2（JQ739460.1）和CsWRKY40（JQ820201.1）2條WRKY基因序列。相關(guān)研究在茶樹轉(zhuǎn)錄組上通過生物信息學(xué)鑒定的方法初步得到50和45個WRKY轉(zhuǎn)錄因子[21-22]；另有報道表明,茶樹CsWRKY2和CsWRKY57通過介導(dǎo)ABA信號途徑參與非生物脅迫響應(yīng)[23-24]。相比于擬南芥、煙草、水稻等模式植物，茶樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄調(diào)控研究才剛起步。本研究根據(jù)茶樹基因組[25]數(shù)據(jù)，以茶樹品種‘鐵觀音’cDNA為模板，克隆獲得茶樹基因CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48的cDNA序列，對它們進行生物信息學(xué)分析，探索其在不同組織、低溫條件、干旱條件和ABA濃度脅迫下的表達模式，為系統(tǒng)研究WRKY基因在茶樹逆境脅迫中的功能提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料及其處理

以茶學(xué)福建省高校重點實驗室種植的生長健壯、無病原菌的兩年生盆栽‘鐵觀音’茶樹為試驗材料，參考姚雪倩等[26]的方法采集以下4類樣品：1）對茶樹根、莖、嫩葉、老葉、花和果實等6個不同組織部位進行取樣；2）對置于人工氣候室4℃低溫處理0、6、12、24、48、72 h后的茶樹部位進行取樣；3）對用10%聚乙二醇-6000（PEG-6000）模擬干旱處理0、6、12 h后的茶樹部位進行取樣；4）對茶樹葉片均勻施用外源100 μmol/L的ABA溶液處理0、6、12、24、48、72 h后的茶樹部位進行取樣。其中3類模擬脅迫處理的樣品均取枝條頂端第2—3片成熟葉為樣品，設(shè)3次重復(fù)，并用錫箔紙包裹標(biāo)記，液氮速凍后存于－80℃冰箱中，備用。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

使用天根多糖多酚植物總RNA提取試劑盒提取樣品總RNA，用NanoDrop2000超微量分光光度計檢測總RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測總RNA質(zhì)量，用全式金Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒合成cDNA，用于逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction,RTPCR）和實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR,qRT-PCR）。

1.3 基因分離

在茶樹品種‘云抗10號’基因組數(shù)據(jù)庫網(wǎng)站（http://www.plantkingdomgdb.com/tea_tree/）中下載基因組數(shù)據(jù)，根據(jù)序列注釋的信息篩選出相關(guān)的WRKYs編碼cDNA序列，并在NCBI網(wǎng)站上與其他植物進行BLASTn比對并獲得更為詳細(xì)的注釋，最后得到3個包含完整開放閱讀框（open reading frame,ORF）的cDNA序列。參照王鵬杰等[27]的方法進行分離驗證。在ORF兩端設(shè)計RT-PCR引物（表1），以‘鐵觀音’芽葉cDNA為模板進行PCR擴增，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30 s；55℃變性30 s，72℃延伸2 min，35個循環(huán)。PCR產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后在紫外燈下切割，使用天根DNA純化回收試劑盒進行回收純化，然后連接到pEASYT1載體上，轉(zhuǎn)化至Trans1-T1感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆送至上海鉑尚生物技術(shù)有限公司測序。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.4 生物信息學(xué)分析

采用UltraEdit軟件分析茶樹基因組數(shù)據(jù)；用NCBI網(wǎng)站中的ORFfinder在線查詢ORF并翻譯出其氨基酸序列，對核酸序列及氨基酸序列分別進行BLASTn和BLASTp同源性分析；采用在線軟件ProtParam（https://web.expasy.org/protparam/）分析蛋白理化性質(zhì)；用SignalP 4.1 Server在線軟件（http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）進行信號肽分析；采用WOLF PSORT軟件進行亞細(xì)胞定位預(yù)測，用cNLS Mapper軟件進行核定位信號預(yù)測；采用SWISS-MODEL軟件預(yù)測蛋白三維結(jié)構(gòu)，再用Pymol軟件編輯輸出；采用DNAman軟件對相關(guān)蛋白進行多序列比對；在MEGA 5.0軟件中用鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，Boostrap值為1 000；采用STRING 10.5軟件進行WRKYs互作蛋白網(wǎng)絡(luò)分析，互作蛋白設(shè)置為10個，置信度設(shè)置為0.15。

1.5 實時熒光定量PCR分析

以茶樹不同組織及3種非生物脅迫處理的樣品總RNA為模板，通過全式金的Easyscript One-step gDNA Removal and cDNA synthesis superMix試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA作為熒光定量PCR模板。選取茶樹β-actin作為茶樹不同組織表達差異的內(nèi)參基因[28]，TATA 結(jié)合蛋白基因（TATA-box binding protein gene,TBP）作為非生物脅迫處理的內(nèi)參基因[29]，設(shè)計CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48的熒光定量引物（表1），設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)。使用Bio-Rad的CFX96 Touch熒光定量PCR儀進行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系參照Transstart?Tip Green qPCR superMix試劑盒的方法，反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性30 s；94 ℃變性5 s，60 ℃延伸30 s，40個循環(huán)。試驗數(shù)據(jù)釆用2－△△CT算法[30]進行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 CsWRKYs基因的分離及序列分析

以‘鐵觀音’芽葉總RNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板進行PCR擴增，獲得3條WRKY轉(zhuǎn)錄因子的cDNA序列，使用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，長度與預(yù)期相符（圖1）。對其核苷酸序列及氨基酸序列分別進行BLASTn和BLASTp同源性分析，根據(jù)與擬南芥WRKY家族的同源性分別命名為CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48，GenBank登錄號分別為 MG298953、MG298958 和 MG298961。CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48的ORF長度依次為1 734、1 299和960 bp，各編碼577、432和319個氨基酸，與擬南芥中WRKY同源基因的序列相似度均在50%以上（表2）。

圖1 茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48基因的PCR擴增結(jié)果Fig.1 PCR amplification results of CsWRKY6,CsWRKY31 andCsWRKY48 genes in tea plant

表2 茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48蛋白生物信息學(xué)分析Table 2 Bioinformatics analysis of CsWRKY6,CsWRKY31 and CsWRKY48 proteins in tea plant

2.2 CsWRKYs蛋白的生物信息學(xué)分析

對蛋白質(zhì)理化性質(zhì)的分析結(jié)果（表2）表明，CsWRKY6、CsWRKY31和 CsWRKY48蛋白的分子質(zhì)量分別為62.99、46.75和35.61 kDa，理論等電點分別為6.11、8.49和6.83，不穩(wěn)定系數(shù)均大于40.00，平均疏水性均為負(fù)值，表明3個WRKY蛋白為不穩(wěn)定的親水蛋白。亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示均定位于細(xì)胞核，再通過核定位信號預(yù)測發(fā)現(xiàn)CsWRKY6氨基酸序列的第310—340位、CsWRKY31的第158—188位和CsWRKY48的第107—138位存在核定位序列，而且CsWRKY6和CsWRKY31的核定位序列一致，推測兩者的同源性較高，功能相近。

2.3 CsWRKYs蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹分析

根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域的數(shù)量及鋅指結(jié)構(gòu)的特征，WRKY家族可被分為3大類。將CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48與擬南芥WRKY家族中的65個WRKY蛋白構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。結(jié)果表明，CsWRKY6與AtWRKY6，CsWRKY31與AtWRKY31，CsWRKY48與AtWRKY48的進化枝分別聚到一起，關(guān)系最近。3個茶樹WRKY均屬于Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，包含單個WRKY保守域和C2H2型鋅指結(jié)構(gòu)。其中，CsWRKY6和CsWRKY31屬于進一步細(xì)分的Ⅱb亞類，CsWRKY48屬于Ⅱc亞類。

圖2 茶樹與擬南芥WRKY蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.2 Phylogenetic tree of WRKY proteins in Camellia sinensis andArabidopsis thaliana

2.4 CsWRKYs蛋白的結(jié)構(gòu)域及三維結(jié)構(gòu)分析

將 CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48和擬南芥WRKY蛋白進行序列比對（圖3），結(jié)果顯示3個茶樹WRKY蛋白均含有高度保守的DNA結(jié)合域（WRKYGQK）和鋅指結(jié)構(gòu)組成的WRKY結(jié)構(gòu)域。其中，Ⅱb亞類的CsWRKY6和CsWRKY31鋅指結(jié)構(gòu)模式為C-X5-C-X23-H-X-H，而Ⅱc亞類的CsWRKY48鋅指結(jié)構(gòu)模式為C-X4-C-X23-H-X-H。

圖3 茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48保守結(jié)構(gòu)域序列比對Fig.3 Alignment of conserved motifs of CsWRKY6,CsWRKY31 and CsWRKY48 in tea plant

以擬南芥WRKY1蛋白WRKY結(jié)構(gòu)域的晶體結(jié)構(gòu)作為模板對CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48的WRKY結(jié)構(gòu)域進行三維蛋白結(jié)構(gòu)建模。結(jié)果（圖4）顯示，3個WRKY結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)高度相似，均由5個反向平行的β折疊和無規(guī)則卷曲組成，說明茶樹WRKY蛋白家族結(jié)構(gòu)域高度保守。

圖4 茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48蛋白WRKY結(jié)構(gòu)域的三級結(jié)構(gòu)Fig.4 Three-dimensional structure of the WRKY domains of CsWRKY6,CsWRKY31 and CsWRKY48 proteins in tea plant

2.5 CsWRKYs的組織表達特異性分析

使用 qRT-PCR 對CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48在茶樹不同組織中的表達量進行分析。結(jié)果（圖5）表明，3個基因在茶樹的根、莖、嫩葉、老葉、茶花和茶果中均有表達，而且表達具有明顯的組織特異性。以茶樹根的表達量為參照（表達量為1）進行分析，發(fā)現(xiàn)CsWRKY6在老葉中的表達量為2.15，顯著高于在茶樹其他組織中的表達量；CsWRKY31在花中的表達量最高，達到5.12；CsWRKY48在根和莖中的表達量最高，明顯高于在葉片、茶花和茶果中的表達量。CsWRKY6和CsWRKY48在茶果中的表達量極低。

圖5 CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48在茶樹不同組織中的表達量Fig.5 Expression level of CsWRKY6,CsWRKY31 andCsWRKY48 in different tissues of tea plant

2.6 CsWRKYs的逆境脅迫分析

利用STRING數(shù)據(jù)庫的擬南芥關(guān)聯(lián)模型搜索與CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48蛋白相互作用的其他蛋白質(zhì)信息，所構(gòu)建的蛋白互作網(wǎng)絡(luò)如圖6所示，3個WRKY蛋白和10個其他蛋白存在直接或間接的相互作用。紅色標(biāo)記的7個蛋白經(jīng)GO數(shù)據(jù)庫注釋和功能分類，與響應(yīng)脅迫相關(guān)。其中：AT1G18390為蛋白激酶超家族中的絲氨酸/蘇氨酸（Ser/Thr）蛋白激酶，涉及ABA信號傳導(dǎo)，正向調(diào)節(jié)非生物脅迫反應(yīng)；FRK1為FLG22誘導(dǎo)的受體激酶，參與植物先天性免疫反應(yīng)。

通過qRT-PCR技術(shù)對CsWRKY6、CsWRKY31、CsWRKY48在低溫、干旱和ABA脅迫下的表達進行了檢測，結(jié)果顯示：在4℃低溫處理條件下（圖7A），3個基因均被誘導(dǎo)上調(diào)表達，其中CsWRKY6和CsWRKY31的表達量在48 h時達到最高，分別為13.77和101.01，CsWRKY48在72 h時達到最大值（19.95），均顯著高于處理0 h；在干旱脅迫條件下（圖7B），CsWRKY6的表達水平?jīng)]有顯著變化，CsWRKY31和CsWRKY48的表達量逐漸上升，均在12 h時達到峰值，分別為12.55和4.35，顯著高于處理0 h階段；ABA處理后（圖7C），CsWRKY48迅速響應(yīng)并上調(diào)表達，在6 h時達到最大值（4.25），顯著高于其他階段，CsWRKY6和CsWRKY31的表達受抑制，在處理后均有下調(diào)。上述結(jié)果表明，3個基因與茶樹逆境脅迫響應(yīng)密切相關(guān)。

圖6 基于擬南芥蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫的茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48蛋白互作網(wǎng)絡(luò)預(yù)測Fig.6 Prediction of interaction networks of CsWRKY6,CsWRKY31 and CsWRKY48 in tea plant based on Arabidopsis protein database

圖7 茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48在3種非生物脅迫處理下的表達量Fig.7 Expression level of CsWRKY6,CsWRKY31 and CsWRKY48 in tea plants under three abiotic stresses

3 討論

植物WRKY基因涉及多種生理過程的轉(zhuǎn)錄調(diào)控，包括各種逆境脅迫和發(fā)育過程[14]。本研究從‘鐵觀音’品種中分離得到3個茶樹WRKY基因，其編碼產(chǎn)物均屬于第Ⅱ類WRKY蛋白，具有高度保守的WRKYGQK核心基序和鋅指結(jié)構(gòu)組成的WRKY結(jié)構(gòu)域，其中Ⅱb亞類的CsWRKY6及CsWRKY31與Ⅱc亞類的CsWRKY48在鋅指結(jié)構(gòu)上有所差異。亞細(xì)胞定位與核定位信號預(yù)測結(jié)果一致，3個基因均具有高置信度的核定位信號，且同屬于Ⅱb亞類的CsWRKY6和CsWRKY31核定位信號序列相同。核定位信號是一種存在于細(xì)胞內(nèi)眾多蛋白質(zhì)中，介導(dǎo)其由細(xì)胞質(zhì)向細(xì)胞核轉(zhuǎn)運的氨基酸序列，對調(diào)節(jié)目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄具有重要作用[31]?；?個茶樹WRKY轉(zhuǎn)錄因子WRKY功能結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)分析顯示，它們均由5個反向平行的β折疊和無規(guī)則卷曲組成，與擬南芥WRKY1相似，表明茶樹WRKY蛋白家族結(jié)構(gòu)域高度保守。

大量研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達具有組織特異性。對3個茶樹WRKY基因的組織表達特征分析發(fā)現(xiàn)，3個基因具有明顯的組織特異性，且表達模式各不相同。CsWRKY6和CsWRKY31分別在茶樹老葉和茶花中優(yōu)勢表達，CsWRKY48則在根和莖中的表達量最高，這可能與脅迫響應(yīng)有關(guān)[32]。茶樹CsWRKY2的組織表達結(jié)果顯示其在葉片中表達量相對較高[23]，與CsWRKY6類似。另外，在擬南芥[2]、蘋果[12]和番茄[10]中WRKY家族的組織表達也呈現(xiàn)出多種相對表達模式。這些結(jié)果表明WRKY基因參與植物生長發(fā)育的多個方面。

近年來，已有諸多研究證明，部分WRKY基因可通過介導(dǎo)ABA信號途徑來響應(yīng)多種逆境脅迫[7,14]。我們通過STRING在線預(yù)測了3個茶樹WRKY基因的潛在蛋白互作網(wǎng)絡(luò)，經(jīng)GO數(shù)據(jù)庫注釋及功能分類，發(fā)現(xiàn)其置信度較高的互作蛋白多與響應(yīng)逆境脅迫相關(guān)。qRT-PCR結(jié)果表明，CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48在低溫、干旱及ABA脅迫處理下均有表達且表達水平有所差異。4℃低溫處理能誘導(dǎo)3個茶樹WRKY基因表達量出現(xiàn)極其顯著的上調(diào)，這與番茄WRKY家族中10個WRKY基因[33]及大豆GmWRKY21[34]的研究結(jié)果類似，表明3個基因參與了茶樹低溫脅迫響應(yīng)的調(diào)控途徑。MOON等[35]將辣椒CaWRKY1在馬鈴薯中異源表達，發(fā)現(xiàn)其能顯著提高植株對干旱的耐受性；郭俊紅等[24]驗證表明茶樹CsWRKY57無轉(zhuǎn)錄激活活性，受干旱誘導(dǎo)短時間內(nèi)爆發(fā)性上調(diào)表達。在本研究中，干旱脅迫處理能顯著上調(diào)CsWRKY31和CsWRKY48的表達，外源ABA處理則抑制CsWRKY6及CsWRKY31的表達，迅速誘導(dǎo)CsWRKY48表達量的上調(diào)。前人研究表明，WRKY轉(zhuǎn)錄因子是ABA信號調(diào)控下游途徑的關(guān)鍵節(jié)點，通過調(diào)控ABA信號轉(zhuǎn)導(dǎo)相關(guān)靶基因如ABF4、ABI4、ABI5、DREB1A、MYB2和RAB18的表達來提高植物對逆境脅迫的耐受性[36]；ABA可以誘導(dǎo)部分WRKY家族基因行使功能，由于植物種類或脅迫環(huán)境不同，有的為正調(diào)控，有的則為負(fù)調(diào)控[17]；WANG等[23]通過外源ABA及ABA生物合成抑制劑證明茶樹CsWRKY2可介導(dǎo)ABA信號途徑參與茶樹對低溫及干旱脅迫的應(yīng)答，意味著CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48可能分別作為負(fù)調(diào)控和正調(diào)控因子參與茶樹響應(yīng)低溫和干旱脅迫的ABA信號調(diào)控途徑，但具體的響應(yīng)調(diào)控機制還有待進一步研究。

總之，本研究克隆得到茶樹CsWRKY6、CsWRKY31和CsWRKY48，通過系統(tǒng)的生物信息學(xué)分析及在不同組織、低溫條件、干旱條件、ABA處理下的表達模式分析，推測這3個基因與茶樹抗逆響應(yīng)密切相關(guān)。它們的功能及作用機制值得后續(xù)通過轉(zhuǎn)基因功能驗證及酵母雜交等技術(shù)來進行研究。

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