高曉月，董彬，張超，付建新，胡紹慶，趙宏波*，梁立軍

（1.浙江農(nóng)林大學風景園林與建筑學院，杭州 311300；2.浙江理工大學建筑工程學院，杭州 310018）

桂花（Osmanthus fragrans）是中國十大傳統(tǒng)名花之一，是集綠化、美化和香化為一體的園林樹種，在中國有悠久的栽培歷史，深受人們喜愛。桂花（本文指的是秋桂）的花在開放前需要一段時間的相對低溫，并且持續(xù)一段時間才能發(fā)揮作用[1]。為了解桂花的開花機制，研究花開放過程中的控制基因就顯得尤為重要。

擴展蛋白作為細胞壁松弛因子，在花開放過程中調(diào)節(jié)細胞擴展，影響花開放進程[2]，其作用機制一般認為是擴展蛋白通過打斷細胞壁纖維素與半纖維素之間的非共價鍵，促使它們之間相互位移，從而引起細胞壁伸展[3]。植物擴展蛋白家族由4個亞家族組成，分別命名為EXPA（α-expansin）、EXPB（β-expansin）、EXLA（expansin-like A）和EXLB（expansin-like B）[4]。研究表明，擴展蛋白影響了種子的萌發(fā)[5]、根毛的起始和延長[6]、莖和葉的生長發(fā)育[7-8]、花粉管的延長[9]、果實的成熟[10]等，幾乎參與了植物的整個生長發(fā)育進程。唐菖蒲（Gladiolus gandavensis）中的擴展蛋白基因GgEXPA1[11]參與了花開放進程，在香石竹（Dianthus caryophyllus）和蠟梅（Chimonanthus praecox）中也發(fā)現(xiàn)了這種影響花開放的基因[12-13]。擴展蛋白家族的大多數(shù)基因受外界環(huán)境的調(diào)控，啟動子中包含了相應的響應元件，因此，研究擴展蛋白基因的啟動子對于了解該基因的調(diào)控機制有重要意義。

本文選擇前期篩選獲得的3個與桂花花開放緊密相關(guān)的擴展蛋白基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1[14]，利用染色體步移法克隆啟動子序列，分析啟動子中包含的順式作用元件；同時，構(gòu)建啟動子融合β-葡萄糖苷酸酶（β-glucuronidase,GUS）報告基因的表達載體，通過農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草，利用組織化學染色觀察報告基因的表達，從而檢測該啟動子的活性。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料

以浙江農(nóng)林大學桂花資源圃栽種的桂花丹桂品種‘堰虹桂’（Osmanthus fragrans‘Yanhong Gui’）為實驗材料，樹齡6—8年。

1.1.2 菌株、質(zhì)粒及試劑

實驗中所用的限制性內(nèi)切酶、T4DNA連接酶、PremixTaq酶、瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA純化試劑盒、DL2000標志物、克隆載體pMD18-T、大腸埃希菌（Escherichia coli）DH5α、In-Fusion?HD克隆試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等均購自TaKaRa公司（大連），X-gluc購自生工生物工程（上海）有限公司，pBI121菌液由浙江農(nóng)林大學觀賞植物遺傳育種實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動子的克隆與調(diào)控元件分析

于2016年9月采集生長健壯的桂花樹幼嫩葉片，采用十六烷基三甲基溴化銨（cetyltrimethylammonium bromide,CTAB）法提取基因組DNA。分別用平末端限制性內(nèi)切酶DraⅠ、EcoRⅤ、PvuⅡ和StuⅠ對基因組DNA進行酶切，構(gòu)建基因組酶切文庫。按照DNA純化試劑盒說明書純化酶切產(chǎn)物，并用T4DNA連接酶將接頭序列添加至基因組DNA酶切片段的5′末端。接頭序列按照Genome Walker說明書合成。分別以本課題組已獲得的OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1基因序列為基礎(chǔ)，設(shè)計3對特異性引物OfEXPA2-GSP1/2、OfEXPA4-GSP1/2和OfEXLA1-GSP1/2，并結(jié)合2條簡并引物AP1、AP2（表1）進行2輪聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）擴增。

以添加過接頭的基因組酶切文庫為預擴增模板，使用接頭引物AP1與基因特異性引物GSP1進行第1輪PCR。反應體系：模板1 μL，簡并引物AP1（10 μmol/L）1 μL，GSP1（10 μmol/L）1 μL，PremixTaq酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性 25 s，72 ℃退火30 s，7個循環(huán)；94 ℃變性25 s，67 ℃退火3 min，35個循環(huán)；67℃延伸7 min。將第1輪PCR產(chǎn)物稀釋50倍作為模板，使用簡并引物AP2與GSP2配對進行第2輪PCR。反應體系：模板 1 μL，接頭引物 AP2（10 μmol/L）1 μL，基因特異性引物 GSP2（10 μmol/L）1 μL，PremixTaq酶10 μL，ddH2O 7 μL。反應程序：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性25 s，72 ℃退火3 min，5個循環(huán)；94℃變性25 s，67℃退火3 min，20個循環(huán)；72℃延伸10 min。

PCR產(chǎn)物經(jīng)過1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，目的條帶按TaKaRa公司瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒說明書進行PCR產(chǎn)物回收；連接反應按照TaKaRa公司pMD18-T載體說明書進行；將連接后的重組質(zhì)粒導入大腸埃希菌DH5α，并用氨芐霉素篩選，挑取白色單菌落進行菌液PCR擴增并送出測序。測序結(jié)果用DNAman軟件進行比對，比對正確的啟動子序列采用植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫Plantcare（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html）在線預測分析可能存在的順式作用元件。

1.2.2 植物表達載體的構(gòu)建

植物表達載體pBI121是一個雙元載體，含有GUS基因系統(tǒng)和CaMV35S啟動子。為了研究OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動子的功能，用其替換植物表達載體pBI121中的35S啟動子，與GUS報告基因融合，構(gòu)建植物表達載體。用HindⅢ和XbaⅠ雙酶切pBI121載體，純化產(chǎn)物。按照In-Fusion?HD克隆試劑盒說明書分別設(shè)計3對上下游引物OfEXPA2-F/R、OfEXPA4-F/R及OfEXLA1-F/R（表1），以桂花基因組DNA為模板進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物純化后分別與pBI121酶切后的純化產(chǎn)物進行連接反應，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸埃希菌DH5α，經(jīng)PCR鑒定后送至生工生物工程（上海）有限公司測序。

表1 引物序列及用途Table 1 Primer sequences and their function

1.2.3 農(nóng)桿菌介導的葉盤法轉(zhuǎn)化煙草及GUS瞬時表達鑒定

將構(gòu)建好的各個重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌GV3101，以GV3101空菌株為陰性對照，含pBI121載體的菌株為陽性對照，對攜帶有重組載體的菌株進行瞬時表達分析。將煙草葉片切成0.5 cm×0.5 cm的小塊后放入吸光度值為0.6的農(nóng)桿菌菌液中侵染10 min，用無菌濾紙將葉片表面的菌液吸干，將經(jīng)侵染的外植體置于被無菌水浸潤的濾紙上，暗培養(yǎng)24 h后進行GUS組織化學染色，用V（醋酸）∶V（乙醇）為3∶1的脫色液浸泡至陰性對照為白色時，用體視顯微鏡（ZEISS CL-6000）進行觀察并拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 啟動子克隆

根據(jù)設(shè)計的引物進行2輪PCR擴增后，分別從EcoRⅤ酶切體系中得到3條較長的片段（圖1），將PCR產(chǎn)物測序結(jié)果與基因序列拼接后，得到了OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1的啟動子片段，長度分別為1 108、808、945 bp。

2.2 啟動子序列分析

采用Plantcare在線預測網(wǎng)站對所得到的啟動子序列進行分析發(fā)現(xiàn)，OfEXPA2啟動子序列中含有大多數(shù)高等植物啟動子具有的保守元件TATA盒（起始密碼子上游－94 bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－179 bp），同時含有脫落酸響應元件、MYB結(jié)合位點、多個光調(diào)控作用元件和參與晝夜節(jié)律調(diào)控的元件（圖2）。

圖1 桂花OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動子擴增Fig.1 Amplification of OfEXPA2，OfEXPA4 and OfEXLA1 promoters from O.fragrans

對克隆的OfEXPA4啟動子片段分析發(fā)現(xiàn)，該序列含有大多數(shù)高等植物啟動子的基本元件TATA盒（起始密碼子上游－80 bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－397 bp），在3′端還存在一個參與基因轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控的5′-UTR Py-rich元件，除此之外，OfEXPA4啟動子序列還含有多個光響應順式作用元件、MYB結(jié)合位點、創(chuàng)傷誘導元件（圖3）。

利用啟動子順式作用元件預測網(wǎng)站Plantcare上相關(guān)軟件對所得的OfEXLA1啟動子序列進行分析發(fā)現(xiàn)：該序列含有大多數(shù)高等植物啟動子的基本元件TATA盒（起始密碼子上游－61bp）和CAAT盒（起始密碼子上游－27bp）。除了這些基礎(chǔ)元件外，在OfEXLA1啟動子區(qū)域中，還發(fā)現(xiàn)了與激素調(diào)控有關(guān)的反應元件：生長素響應元件、水楊酸響應元件。另外，在OfEXLA1啟動子序列中還發(fā)現(xiàn)了熱激響應元件HSE、MYB結(jié)合位點MBSⅡ和4個光響應元件（圖4）。

圖2 OfEXPA2啟動子序列及順式作用元件Fig.2 Sequences and cis-elements of OfEXPA2 promoter

2.3 轉(zhuǎn)基因煙草葉片GUS組織化學染色

將構(gòu)建好的重組載體命名為OfEXPA2∶∶GUS、OfEXPA4∶∶GUS 和OfEXLA1∶∶GUS，并與 pBI121（CAMV35S∶∶GUS）空載體用凍融法轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，其中pBI121空載體為陽性對照，GV3101為陰性對照，通過葉盤法轉(zhuǎn)化煙草進行瞬時表達。結(jié)果表明：轉(zhuǎn)CAMV35S啟動子和轉(zhuǎn)化OfEXPA2∶∶GUS、OfEXPA4∶∶GUS、OfEXLA1∶∶GUS的煙草葉片經(jīng)GUS組織化學染色后均有藍色，其中OfEXPA2∶∶GUS 的染色最深，其次是OfEXLA1∶∶GUS，而OfEXPA4∶∶GUS染色最淺，而陰性對照沒有藍色（圖5）。說明克隆的3種啟動子均能驅(qū)動報告基因GUS的表達。

圖3 OfEXPA4啟動子序列及順式作用元件Fig.3 Sequences and cis-elements of OfEXPA4 promoter

圖4 OfEXLA1啟動子序列及順式作用元件Fig.4 Sequences and cis-elements of OfEXLA1 promoter

3 討論

高等植物基因的表達受到多種因素的影響，但是主要發(fā)生在調(diào)控水平上，受多種順式作用元件與反式作用因子的相互協(xié)調(diào)作用[15]；因此，了解基因的調(diào)控網(wǎng)絡取決于對順式作用元件的分析[16]。在擴展蛋白家族中，一些擴展蛋白基因受激素的調(diào)控。MaExp1是香蕉（Musa acuminata）果實中的特異性基因，在MaExp1啟動子中存在乙烯和生長素的響應元件，實驗證明乙烯和生長素能夠協(xié)同作用增強該基因的表達[17]。棉花（Gossypium barbadense）擴展蛋白基因GbEXPA2啟動子中有脫落酸和赤霉素響應元件，外源赤霉素和脫落酸分別能夠上調(diào)和下降GbEXPA2的表達[18]。水稻中擴展蛋白的活性在干旱脅迫下受到生長素和脫落酸的誘導[19]。在洋桔梗（Eustoma grandiflorum）中，茉莉酸甲酯能夠促進EgEXPA2、EgEXPA3和EgXTH1的表達，推動花瓣中細胞壁的松弛，從而影響花開放進程[20]。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)，在OfEXPA2啟動子中含有脫落酸響應元件，在OfEXLA1啟動子中含有生長素響應元件、水楊酸響應元件。因此，推測OfEXPA2和OfEXLA1啟動子能夠在激素的誘導下調(diào)控基因的表達。

除各類激素元件外，OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1的啟動子中還存在溫度、干旱脅迫等相關(guān)元件。在OfEXLA1啟動子中存在熱激元件HSE，該元件能夠和參與熱脅迫的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，啟動下游基因的表達，提高或降低植物的耐熱性[21]。除此之外，MBS元件、MBSⅡ元件分別與其中MYB轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合參與干旱脅迫的響應和類黃酮的合成，其中MYB轉(zhuǎn)錄因子廣泛分布在植物中，并與脫落酸合成有關(guān)，能夠與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用[22]。目前，參與類黃酮合成的MYB轉(zhuǎn)錄因子有AtMYB011/AtMYB012/AtMYB111[23]、EsMYB[24]等，參與干旱脅迫響 應 的 有AtMYB002、AtMYB060/AtMYB094[25]、AtMYB096[26]等，其中，AtMYB102和AtMYB096受外源脫落酸的誘導。在本研究的OfEXPA2啟動子中有脫落酸響應元件，推測脫落酸響應元件與MYB結(jié)合位點共同作用于OfEXPA2啟動子，從而調(diào)控目的基因的表達。

通過對啟動子和GUS融合表達載體的轉(zhuǎn)基因煙草葉片研究發(fā)現(xiàn)，OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動子均能夠驅(qū)動下游基因的表達。其中OfEXPA2啟動子染色最深，OfEXPA4啟動子染色最淺，可能是由于擴展蛋白基因在不同的組織器官中的表達活性不同。

綜上所述，在本研究中啟動子活性可能受到激素的誘導并使得相關(guān)擴展蛋白基因的表達發(fā)生變化，影響花開放。下一步研究將構(gòu)建脫落酸、生長素、水楊酸響應元件的缺失載體，分析不同缺失啟動子片段誘導表達活性的強弱，從而確定激素對啟動子的作用，期望通過對OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1啟動子的深入研究來為揭示桂花花開放的分子機制提供理論依據(jù)。

圖5 瞬時表達檢測結(jié)果Fig.5 Detection result of transient expression

4 結(jié)論

本研究克隆了桂花花開放相關(guān)基因OfEXPA2、OfEXPA4和OfEXLA1起始密碼子上游1 108、808、945 bp的啟動子序列，在這3個啟動子序列中均存在基本元件TATA盒和CAAT盒，以及激素誘導元件和干旱、高溫等多個與植物非生物脅迫相關(guān)的元件；通過煙草葉片瞬時表達證明這3個啟動子均能驅(qū)動下游基因的表達。

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