鄭好，呂夏晨，譚賽瓊，路雪麗，張弦，張曉勤，薛大偉

（杭州師范大學生命與環(huán)境科學學院，杭州 310036）

干旱是世界上最為嚴重的災害之一，其出現(xiàn)次數(shù)、持續(xù)時間、影響范圍、造成的損失等均居各種自然災害之首[1]。大麥（Hordeum vulgare）是一種生產(chǎn)面積僅次于小麥、玉米和水稻的重要糧食作物[2]。在大麥生長季節(jié)，常常遭遇到不同程度的干旱脅迫，嚴重地影響了大麥的生產(chǎn)。因此，研究抗旱作物新品種有利于解決世界糧食問題，同時也是當下研究領域的一大熱點。

蠟質是覆蓋在大多數(shù)陸生植物表面、能夠保護植物免受生物和非生物脅迫的疏水表層。植物表皮蠟質在對抗各種逆境中發(fā)揮著巨大的作用，如抵御干旱等功能，對植物適應外界環(huán)境起到了非常重要的作用[3]。張海祿等[4]研究發(fā)現(xiàn)，大麥蠟質含量與水分利用效率之間的相關性達到了顯著水平，認為表皮蠟質含量能夠反映出水分利用效率的高低。某些植物的蠟質缺失突變體均表現(xiàn)出了對外界環(huán)境中水分含量的敏感性，如擬南芥的cer突變體[5]。這些均充分說明蠟質在植物自身的抗逆響應機制中具有積極的作用。當下，對蠟質的成分和形態(tài)已經(jīng)有了較深的研究，但植物蠟質合成和相關調控非常復雜，所以目前對于植物蠟質在干旱脅迫下相關基因的響應機制還未十分明確。這些基因的詳細功能和調控需要進一步研究，特別是關于蠟質代謝的關鍵基因，包括其參與蠟質代謝調節(jié)所起的具體作用[3]。

我們在大麥浙農(nóng)大3號（ZJU3）的甲基磺酸乙酯（ethylmethylsulfone,EMS）突變體庫中鑒定到1個典型的表皮蠟質突變體[6]。經(jīng)過多年選育，其性狀能穩(wěn)定遺傳，命名為P1，該突變體莖稈、穗部、葉鞘蠟粉缺失，但葉片蠟質含量正常。本文通過研究干旱處理下大麥蠟粉缺失突變體P1和野生型大麥ZJU3的生理生化指標及10個蠟質相關基因表達情況，以期進一步了解蠟質合成相關基因響應干旱脅迫的分子機制；并比較二者在干旱脅迫下是否會表現(xiàn)出不同的生理及分子響應機制。研究結果將為培育具有優(yōu)良抗旱性狀的作物品種提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

取野生型大麥ZJU3、蠟粉缺失突變體P1種子，脫粒，備用。

1.2 試驗處理

將大麥種子（P1、ZJU3）用 0.1%H2O2消毒 10 min，蒸餾水沖洗，暗處萌發(fā)24 h后，種植于培養(yǎng)盒中。當幼苗生長到1葉1心時轉移到1/2霍格蘭（Hoagland）營養(yǎng)液中培養(yǎng)。幼苗生長到2葉時，用一定濃度的聚乙二醇（macrogol）6000（PEG-6000）溶液模擬干旱脅迫處理。生理生化試驗設定3個濃度梯度（0%、10%、20%PEG）處理，分別在干旱處理0、24、48 h時取大麥幼苗葉片測定各項生理生化指標?；虮磉_研究設定2個濃度梯度（0%、20%PEG）處理，在干旱處理24 h時取葉片進行測定。其中Hoagland營養(yǎng)液的配方為：48.2 mg/L(NH4)2SO4，65.9 mg/L MgSO4，15.9 mg/L K2SO4，18.5 mg/L KNO3，59.9mg/LCa(NO3)2，24.8mg/LKH2PO4，5mg/L FeC6H5O7，0.9 mg/L MnCl2·4H2O ，0.11 mg/L ZnSO4·7H2O ，0.04 mg/L CuSO4·5H2O ，2.9 mg/L HBO3，0.01 mg/L H2MoO4。

1.3 生理生化指標的測定

參考朱雙艷的方法[7]：超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）活性測定采用氮藍四唑（NBT）光化還原法，以抑制50%的NBT光化還原為一個酶活性單位（U）；過氧化物酶（peroxidase,POD）活性測定采用愈創(chuàng)木酚法；MDA含量測定采用硫代巴比妥酸（TBA）法。脯氨酸（proline,Pro）含量測定使用脯氨酸（Pro）含量測試盒（江蘇省蘇州科銘生物技術有限公司），具體步驟參考說明書。

1.4 干旱脅迫下大麥幼苗10個蠟質基因的表達分析

1.4.1 總RNA的提取

參考RNeasy?Plant Mini Kit試劑盒（QIANGEN公司，德國）提取葉片總RNA，并用DNase I（RNase free）去除DNA污染。

1.4.2 cDNA的合成

參考ReverTra Ace?qPCR RT Master Mix試劑盒（TOYOBO，日本）的說明書，將各樣品總RNA反轉錄合成cDNA第一條鏈。獲得的cDNA產(chǎn)物直接用于聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction,PCR）或于－20℃冰箱中貯藏，備用。

1.4.3 特異性引物的設計

選取表1中所列的10個基因，所得序列在GenBank中比對，找到大麥中的同源基因序列。根據(jù)實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）的引物設計原則，利用Primer Premier v5.0 軟件設計各基因的引物。

表1 大麥蠟質合成相關基因引物Table 1 Primers of barley wax synthesis related genes

1.4.4 各基因目的片段的普通PCR擴增

PCR反應體系（25 μL）：2.5 μL 10×PCR 緩沖液（含 MgCl2），0.5 μL dNTP 混合物，0.5 μL上游/下游引物，1 μLTaqDNA聚合酶，1 μL cDNA，19 μL無菌水。PCR程序：95℃預變性3 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸90 s，40個循環(huán)。擴增后取10 μL擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進行分析，檢查反應產(chǎn)物及長度。

1.4.5 基因的實時熒光定量PCR及數(shù)據(jù)分析

采用CFX96 Real-Time PCR Detection System（Bio-Rad公司，美國）進行各基因的實時熒光定量PCR（real-time quantitative PCR,RT-qPCR）分析。實時熒光定量PCR反應體系（10 μL）：5 μL SYBR Green Fast qPCR Master Mix(BBI)，0.5 μL 上游/下游引物，2 μL cDNA，2 μL無菌水。實時熒光定量PCR程序：95℃預變性10 s；95℃變性5 s，55℃退火并延伸30 s，40個循環(huán)。試驗數(shù)據(jù)采用相對定量法分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗數(shù)據(jù)采用SigmaPlot 10.0和SPSS 20.0軟件進行統(tǒng)計分析，采用配對t檢驗法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 干旱對大麥幼苗抗氧化酶活性的影響

SOD是植物體內清除氧自由基的一種重要的保護酶。由圖1A可知：在10%PEG處理下，P1的SOD活性呈先上升后下降的趨勢，而ZJU3的SOD活性呈持續(xù)上升的趨勢。而在20%PEG處理下，P1的SOD活性持續(xù)維持在較低水平，且呈緩慢增長的趨勢；ZJU3的SOD活性呈先上升后下降的趨勢。

在植物體內，POD酶具有和SOD酶相似的功能。由圖1B可知：在不同濃度的PEG處理下，P1和ZJU3的POD活性均呈先上升后下降的趨勢；P1和ZJU3之間POD活性變化在干旱處理24 h時呈顯著性差異。由上可知：同為抗氧化酶的SOD和POD的活性變化規(guī)律具有相似性；蠟粉缺失突變體P1的抗逆性要弱于野生型ZJU3，說明蠟粉的缺失造成了突變體P1抗逆性的減弱。

2.2 干旱對大麥幼苗Pro和MDA含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的最終產(chǎn)物之一，也是衡量膜系統(tǒng)受害的重要指標之一，用于表示細胞膜脂過氧化程度和植物對逆境條件反應的強弱。由圖2A可知：在10%PEG處理下，P1和ZJU3的MDA含量未見明顯差異。而在20%PEG處理下，P1和ZJU3的MDA含量急劇上升，說明膜系統(tǒng)受到嚴重損害。在PEG處理下，總體上ZJU3的MDA含量要略低于P1，說明其抗逆性較好。由此可知，蠟粉缺失突變體P1在干旱脅迫時，調節(jié)能力較野生型ZJU3差，細胞膜損傷較嚴重。

Pro是調節(jié)植物水分脅迫條件下細胞水勢的物質之一。SINGH等研究了在水分脅迫下大麥體內游離脯氨酸積累的品種間差異，得出其與品種的抗旱性呈正相關的結論[8]。由圖2B可知：在不同濃度的PEG處理下，P1和ZJU3的Pro含量均呈持續(xù)上升的趨勢。ZJU3的上升速率要略大于P1，說明其抗逆性較好。

圖1 干旱脅迫下大麥幼苗的抗氧化酶活性Fig.1 Antioxidant enzyme activities of P1 and ZJU3 seedlings under drought stress

2.3 干旱對大麥幼苗蠟質基因表達的影響

本研究所選取的10個蠟質基因全部被成功檢測，溶解曲線峰值單一性良好，沒有非特異性擴增。把野生型ZJU3的基因表達量作為1，對比分析蠟粉缺失突變體P1的基因表達量。由圖3可知：干旱處理24 h后，選取的10個蠟質基因中，有6個基因表達下調，分別是CER60、LACS1、WIN1、CER10、FTSH10和WRKY57，與ZJU3相比，在P1中表達量分別下調了40%、50%、50%、95%、47%和73%。有3個基因表達上調，分別是CER6、MYB94和DWA1，在P1中的表達量分別是ZJU3中的1.4倍、2.1倍和3.6倍。另有1個基因WIN2表達量未見明顯差異。除WIN2外，P1所測基因相對于ZJU3均呈顯著性差異。

圖2 干旱脅迫下大麥幼苗的Pro和MDA含量Fig.2 Pro and MDA contents of P1 and ZJU3 seedlings under drought stress

3 討論

植物在正常的生長條件下，體內活性較高的保護酶系統(tǒng)使活性氧的產(chǎn)生和清除維持在一個動態(tài)平衡之中。而逆境脅迫打破了這種動態(tài)平衡，迫使植物體內的活性氧迅速產(chǎn)生，其對植物的生長具有強烈的破壞作用。在植物保護酶系統(tǒng)中，SOD和POD共同作用可將H2O2轉化為H2O，使自由基保持在較低水平，從而避免膜的損傷。在本次試驗中，在干旱脅迫下，P1的SOD活性出現(xiàn)降低的趨勢，說明超出了其調控范圍，保護酶系統(tǒng)受到了損傷。而在干旱脅迫下，P1和ZJU3之間POD活性均呈先上升后下降的趨勢，未見顯著性差異。這可能與大麥幼苗較小、干旱脅迫均對其造成了損傷有關。在需氧生物中，活性氧代謝失調時自由基的積累及自由基對大分子的破壞作用是遭受逆境迫害時的重要特征[9]。在植物組織中，隨著活性氧的增多，也加劇了膜脂過氧化程度，MDA可作為衡量過氧化程度的指標，以間接測定膜系統(tǒng)的受損程度及植物的抗逆性[10]。在20%PEG處理下，P1和ZJU3的MDA含量急劇上升，但是P1的MDA含量較高，說明P1的膜系統(tǒng)受害更為嚴重。脯氨酸(Pro)是調節(jié)植物水分脅迫條件下細胞水勢的物質之一，Pro含量的積累反映了植物對不良環(huán)境條件的忍耐能力[11-12]。ZJU3中Pro含量的上升速率大于P1，說明其耐受性較好。綜上所述，野生型ZJU3的抗逆性要高于蠟粉缺失突變體P1，可推測蠟質的存在可直接或間接地提高植株的抗旱能力。

圖3 干旱脅迫下苗期無蠟粉突變體P1與野生型ZJU3蠟質基因表達情況Fig.3 Expression of waxy genes of mutant P1 and wild-type ZJU3 seedlings under drought stress

植物對干旱脅迫的應答過程中發(fā)生的一系列生理生化變化，是復雜的內在分子機制調控的結果。植物在逆境下蠟質相關基因的表達情況與其抗逆性密切相關。在本試驗選取的10個基因中，P1相對于ZJU3有6個基因表達下調，3個基因表達上調，1個基因表達未見明顯差異。CER6基因是與超長脂肪酸合成特異相關的關鍵基因，在cer6突變體中，莖上幾乎不存在蠟質[13]。CER60作為CER6的同源基因，可能受到CER6高表達的影響反而表達被抑制。這與CER60在P1中表達量約為ZJU3的60%這一試驗結果相符。MYB94轉錄因子已經(jīng)被證實通過WSD1、KCS2/DAISY、CER2、FAR3和ECR基因表達的上調來激活蠟質的合成[14]。由結果推測，MYB94轉錄因子的過表達可能還作用于CER6基因，促進其表達。LACS1基因[15]和DWA1基因[16]均和?；o酶A（CoA）的形成有關，但在結果中表達量變化未一致，需進一步研究。擬南芥中WIN1／SHN1基因及其同源基因SHN2和SHN3是最早被發(fā)現(xiàn)與表皮蠟質合成有關的轉錄因子，后續(xù)的報道證實WIN1能夠直接參與角質合成的調控并間接影響蠟質的積累[17-18]，與本次試驗中P1的WIN1基因低表達這一結果相符。ECR/CER10催化的反應是超長鏈脂肪酸延長的最后一步[19]，可能是該基因的低表達導致了突變，體P1的無蠟性狀。FTSH10基因和WRKY57基因此前已被報道參與植物對干旱脅迫的反應[20-21]。本次試驗中，F(xiàn)TSH10基因和WRKY57基因均低表達。推測突變體P1在CER10基因上發(fā)生了突變，導致其無蠟性狀。由于CER10的低表達，可能導致在其下游將長鏈脂肪酸轉化為?；o酶A相關的基因DWA1過表達。同時，CER10的低表達可能導致了在其上游的MYB94基因和蠟質合成關鍵基因CER6過表達。由結果推測，可能存在某一調控蠟質合成的未知基因發(fā)生了突變，導致相關轉錄和調控基因低表達。

4 結論

在干旱脅迫下，大麥蠟粉缺失突變體和野生型在生理生化及蠟質基因表達模式上存在不同，表明了蠟粉缺失突變體的特性和性狀產(chǎn)生與蠟質基因有關，以及野生型較無蠟粉突變體在抗逆性上的優(yōu)勢。由于蠟質的相關機制還十分復雜，因此需要對相關基因的功能和作用機制進行深入的研究。

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