馬文濤，王少云，張 鑫，李皓瑜

(延安大學(xué) 化學(xué)與化工學(xué)院，陜西 延安 716000)

牡丹( Paeonia suffruticosa Andr.) 為毛茛科芍藥屬落葉灌木[1]，分為觀賞牡丹和油用牡丹兩大類，油用牡丹結(jié)籽量大、適應(yīng)性強(qiáng)，且油品品質(zhì)較佳，具有很好的經(jīng)濟(jì)效益、生態(tài)效益及社會效益[2]，因而被廣泛種植在山東、安徽、河南、陜西等地[3]。2011年，牡丹籽油通過國家新資源食品認(rèn)證，但牡丹籽粕作為牡丹籽油生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物被直接作為廢棄物丟棄[4]，因此，研究牡丹籽粕中的其他功能性成分對提高牡丹籽綜合利用率有重要意義。

目前，國內(nèi)外對牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)(PSAF)的研究較少，黃酮類化合物天然具有較好的抗氧化、抗炎、抗菌等作用，其保健和藥用價(jià)值已逐漸成為研究熱點(diǎn)[5-6]。本研究對通過單因素和響應(yīng)面相結(jié)合對牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，還通過羥基自由基清除能力和超氧陰離子自由基清除能力三個方面考察牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的抗氧化能力，為更好地綜合利用油用牡丹提供理論基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料與儀器

牡丹籽粕，采集自工廠對牡丹籽壓榨制油后所得。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(AR≧98%)、DPPH( 1，1-二苯基-2-三硝基苯肼，AR≧ 95%)(Sigma公司)；乙醇、硝酸鋁等均為分析純。

AUY220電子分析天平(日本島津公司)、PRD-C3000電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(HASUC)、UV-2550紫外可見分光光度計(jì)(日本島津公司)、KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)、湘儀H1850離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

牡丹籽粕→干燥→粉碎→超聲輔助溶劑提取→離心(4000 r/min，20min)→取上清液→測定

采用硝酸鋁顯色法[7]，測定牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)含量的測定，以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)品，在510 nm處測定吸光強(qiáng)度，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算結(jié)果。

精確稱取5 g的牡丹籽粕，采用單一變量法，依次考察不同提取時間、不同乙醇濃度、不同超聲波功率及不同提取溫度對于牡丹籽粕中總黃酮提取率的影響，具體條件變量如表1。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次。

表1 考察因素及變量

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用 Box-Behnken 中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，以牡丹籽粕中總黃酮提取率為評價(jià)指標(biāo)，選取影響黃酮提取率較顯著的因素，優(yōu)化牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)提取工藝條件。

1.2.5.1 羥基自由基清除試驗(yàn)[8]

采用 H2O2/Fe2+氧化法，分別移取2 mmol·L-1FeSO4溶液2 mL，2 mL 1 mmol·L-1H2O2溶液和3 mL 6 mmol·L-1水楊酸溶液和2 mL蒸餾水于試管中混勻，恒溫37 ℃水浴30 min，在分光光度計(jì)中于510 nm處測得其吸光度為A1；將上述蒸餾水換成不同濃度的牡丹籽粕黃酮溶液、TBHQ溶液、Vc溶液2 mL，搖勻后同樣置于37℃水浴30min，測定吸光度A2；再用蒸餾水代替雙氧水作對照實(shí)驗(yàn)測得的吸光度為A3，根據(jù)公式計(jì)算樣品對羥基自由基的清除率I%。

1.2.5.2 超氧陰離子自由基清除試驗(yàn)

采用Design-Expert.V10.0軟件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 超聲波功率對牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

如圖1所示，超聲功率對黃酮提取率的影響呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，當(dāng)超聲波功率達(dá)到120 W時，牡丹籽粕中黃酮類化合物的提取率達(dá)到最大，為0.68 %，隨著超聲功率的增加，總黃酮提取率降低，這可能是因?yàn)檫^大的超聲波功率會導(dǎo)致大分子雜質(zhì)也加速溶出，影響了黃酮類物質(zhì)的相對溶出率[10]。故牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的最佳的超聲功率為120 W。

圖1 超聲波功率對牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

2.1.2 提取溫度對牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

圖2 溫度對牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

由圖2可知，隨著溫度上升，牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)的提取率也隨之升高，當(dāng)提取溫度到達(dá)50 ℃時，牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的提取率達(dá)到最高，為0.98 %。當(dāng)溫度介于20～50 ℃內(nèi)，提取率上升明顯，超過50 ℃之后，提取率反而下降，說明溫度過高可能會破壞牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)的結(jié)構(gòu)，故牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)最佳提取溫度為50 ℃。

圖3所示，乙醇濃度從40 %增大到50 %時，黃酮得率逐漸顯著增加，此時黃酮得率最高為1.36 %；隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，總黃酮類物質(zhì)的提取率反而逐漸下降，這可能是因?yàn)楫?dāng)乙醇濃度繼續(xù)增大時，會將油粕中其它脂溶性物質(zhì)提取出來[11]，影響牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的溶出，從而導(dǎo)致總黃酮得率的降低。同時，根據(jù)相似相溶原理，推測牡丹籽粕中黃酮類化合物的極性與50 %乙醇溶液最為接近，且在乙醇濃度為50 %時，黃酮類物質(zhì)溶出趨于飽和。

圖3 乙醇濃度對牡丹籽粕中黃酮提取率的影響

由圖4可知，黃酮類物質(zhì)的提取率在超聲時間為30 min時最高，達(dá)到1.46 %。在30 min之后黃酮提取率略微減小但基本保持不變。這是因?yàn)槌晻r間為30 min時，油粕和乙醇溶液充分接觸，使得油粕中黃酮類化合物溶出比較充分，但當(dāng)時間超過30 min后，已經(jīng)溶出的黃酮類物質(zhì)有可能發(fā)生降解或伴隨其他大分子雜質(zhì)的溶出[12]，使得提取率略微下降，但基本保持不變，故超聲波輔助提取牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的最適時間為30 min。

圖4 超聲時間對牡丹籽粕中黃酮類物質(zhì)提取率的影響

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，固定提取時間為30 min，選取乙醇濃度、提取功率和溫度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，利用Design-ExpertV10.0設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken模型，對響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果如表2進(jìn)行多元回歸擬合，得到牡丹籽粕黃酮提取率(Y)對乙醇濃度(A)、提取功率(B)、溫度(C)的二次多項(xiàng)式回歸模型：Y=1.388 + 0.0575 * A + 0.0325 * B + 0.045 * C -0.0225 * AB + 0.0425 * AC -0.0225 * BC -0.19525 * A^2 -0.06025 * B^2 -0.07525 * C^2。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果

表2(續(xù))

對模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3，從表3可得，此模型的P<0.0001，即響應(yīng)面回歸法建立的模型達(dá)到極顯著水平，表明實(shí)驗(yàn)方法可靠，同時方程失擬項(xiàng)P=0.8335，影響不顯著，則表明模型選擇合適，其預(yù)測值與實(shí)際值接近，可用此模型分析和預(yù)測牡丹籽粕中黃酮提取率隨各影響因素的變化規(guī)律。另，從F值可以看出，對于牡丹籽粕黃酮提取影響因素主次排序?yàn)椋篈(乙醇濃度)>C(溫度)>B(功率)，由P值可知，乙醇濃度、溫度和功率三者對牡丹籽粕黃酮提取率的影響均極顯著，乙醇濃度和溫度、乙醇濃度和功率兩因素的交互影響顯著，二次項(xiàng)A2、B2、C2也有極顯著影響，表明這三項(xiàng)因素均有牡丹籽粕黃酮提取率有直接關(guān)系。

表3 回歸模型的方差分析

圖5 各因素交互作用對牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)提取率的影響

為了使各因素之間交互作用更為直觀的反映出來，以牡丹籽粕黃酮的提取率為響應(yīng)值，分別將模型中A、B和C因素固定在中間的水平上，得出另外兩個因素交互作用對超聲輔助法提取的牡丹籽粕黃酮模型，病根據(jù)該模型繪制三維曲面圖與等高線圖。從等高線圖可得出兩個影響因素間交互作用的顯著程度，圓形表示兩個因素之間交互作用不顯著(p>0.05)，橢圓形則表示兩個因素之間交互作用顯著(p<0.05)[13-14]。即，乙醇濃度與溫度和乙醇濃度與功率之間交互作用明顯，而功率和溫度的交互作用對提取率影響并不明顯，這與方差分析結(jié)果一致。

通過對響應(yīng)面試驗(yàn)?zāi)Ｐ偷姆治?，在提取時間固定為30 min的基礎(chǔ)上，得到提取牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的最佳條件為，乙醇濃度51.67 %，超聲功率125.03 W，提取溫度為52.58 ℃，此時總黃酮提取率的預(yù)測值為1.43 %。基于實(shí)驗(yàn)操作性的考慮，將提取條件調(diào)整為乙醇濃度50 %，超聲功率120 W，提取溫度為50 ℃，測定黃酮提取率平均值為1.44 %，與理論預(yù)測值差異不大，表明采用優(yōu)化條件可靠，對用于牡丹籽粕黃酮提取的實(shí)際操作有一定的指導(dǎo)價(jià)值。

2.3 牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)體外抗氧化活性研究

圖6 不同質(zhì)量濃度的樣液對羥基自由基的清除率

·OH自由基是活性氧中活性最強(qiáng)的自由基，可與細(xì)胞內(nèi)的一切有機(jī)化合物發(fā)生反應(yīng)，通過破壞脂肪、蛋白質(zhì)和核酸代謝來損傷細(xì)胞的結(jié)構(gòu)與功能，從而導(dǎo)致機(jī)體病變[15]。由圖6可知，牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)在0～40 μg /mL范圍內(nèi)，隨著質(zhì)量濃度的增大，對·OH自由基的清除率逐漸增加，當(dāng)質(zhì)量濃度為40 μg /mL時，·OH清除率達(dá)到40.94 %，繼續(xù)增大濃度，對·OH清除率影響不大。

圖7 不同質(zhì)量濃度的樣液對超氧陰離子自由基的清除率

由圖7可得，對于牡丹籽粕黃酮粗提物而言，當(dāng)質(zhì)量濃度小于40 μg /mL時，對 自由基清除率僅為20 %左右，在質(zhì)量濃度40～80 μg /mL范圍內(nèi)，清除率幾乎呈線性增大，可達(dá)56.63 %，繼續(xù)增大質(zhì)量濃度，清除率則趨于不變。而抗氧化劑TBHQ、Vc對 自由基的清除能力皆優(yōu)于牡丹籽粕黃酮粗提物提取液，當(dāng)質(zhì)量濃度均為80 μg /mL時，三者對于 自由基清除率分別為87.67 %、83.21 %和56.63 %，表明牡丹籽粕黃酮類化合物提取液具有良好的 自由基清除能力。

3 結(jié)論

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面法得出最優(yōu)牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)的超聲波輔助提取條件為:乙醇濃度50 %，超聲功率120 W，提取溫度50 ℃，超聲時間30 min，此時牡丹籽粕總黃酮提取率為1.44 %。

體外抗氧化活性表明，牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)提取液對·OH自由基和 自由基均有較好的清除效果，說明牡丹籽粕黃酮類物質(zhì)具有較好的抗氧化能力，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果為牡丹籽粕在榨油之后的再利用提供了思路，同時也為研究牡丹籽粕中的天然抗氧化劑提供了理論依據(jù)。