黃升財，王冰，謝國強，劉中來，張美娟，張樹清，程憲國

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赤霉素GA4是水稻矮化特征的重要調節(jié)因子

黃升財1，王冰1，謝國強2，劉中來2，張美娟1，張樹清1，程憲國1

（1中國農業(yè)科學院農業(yè)資源與農業(yè)區(qū)劃研究所，北京 100081；2九江農業(yè)科學院，江西九江 332101）

【目的】以水稻幼胚組培過程中獲得的一株半矮化水稻突變體為研究對象，解析水稻半矮化突變體株高變矮及分蘗增多等表型異常的原因，為克服水稻過度矮化發(fā)育障礙因子及培育抗倒伏高產水稻品種提供科學理論依據?！痉椒ā渴紫冉y(tǒng)計分析半矮化水稻突變體與野生型的表型差異，利用體式顯微鏡和光學顯微鏡觀察突變體花的結構及其細胞特征；通過轉錄組測序及qRT-PCR分析差異基因的表達特征，并通過外源噴施赤霉素GA3處理檢測突變體對外源赤霉素的敏感性；最后利用高效液相色譜和質譜聯(lián)儀檢測突變體內赤霉素的含量與富集特征。【結果】表型觀測與統(tǒng)計結果表明，突變體水稻株高比野生型減少56.59%，有效分蘗數高出47.44%，差異均達到極顯著水平。突變體的表皮毛消失且花發(fā)育遲緩，雄蕊變小。盡管突變體分蘗數較高但結實率明顯降低，僅為野生型的12.62%，且種子長度和寬度均減小，差異極顯著。通過顯微鏡觀察莖的縱切切片，發(fā)現突變體細胞長度減少23%，差異極顯著。外源噴施赤霉素后突變體的株高、有效分蘗、結實率、種子大小、表皮毛和莖稈細胞長度均有不同程度的恢復，說明植物體內赤霉素合成不足可能是引起水稻矮化的主要原因。轉錄組測序結果顯示突變體中顯著上調，qRT-PCR驗證結果與轉錄組測序結果一致。由于OsGA13ox控制GA12轉化為GA53，而GA12和GA53分別轉化為GA4和GA1，GA4的活性高于GA1，因此，突變體中GA4減少可能是導致半矮化的主要原因。赤霉素檢測結果表明突變體中GA4含量減少94.9%，與預測結果一致。此外，D14作為SL（獨腳金內酯）的特異性受體，參與調控植物SL信號轉導，抑制枝條分枝或者分蘗。qRT-PCR結果顯示，與野生型相比，突變體中顯著下調，而經過GA3處理的野生型和突變體中均顯著上調。上調可能導致有效分蘗數減少，而其下調可能致使有效分蘗數增加。統(tǒng)計結果表明突變體中有效分蘗顯著增多，而經過GA處理之后，野生型和突變體有效分蘗數均顯著低于未經GA3處理前，表明在水稻中的表達可能受到GA的調控從而影響水稻分蘗?！窘Y論】異常表達導致活性更高的GA4在水稻中的富集減少，形成水稻半矮化突變體；赤霉素可能通過影響的表達間接調控水稻的分蘗。

水稻；半矮化突變體；；赤霉素GA4；；有效分蘗

0 引言

【研究意義】水稻是人類生存至關重要的糧食作物之一，水稻產量通常由分蘗數、穗粒數、單粒重及株高等農藝性狀決定。隨著人口壓力逐漸增加，耕地面積逐漸減小，氣候和環(huán)境惡化等問題的出現，人類對糧食產量和質量的要求愈來愈高。探明水稻矮化和分蘗增多的分子機制，為培育抗倒伏及高有效分蘗的水稻品種提供科學的理論支持，對保證人類糧食安全具有重要的意義。【前人研究進展】植物生長高度在很大程度上受內源激素的影響，包括赤霉素[1-2]、油菜素類固醇[3-4]以及獨腳金內酯[5-6]等。其中赤霉素（GAs）是一類二萜類化合物，可促進植物生命周期各個階段的生長：種子萌發(fā)、莖伸長、葉片膨大、開花和花發(fā)育[7]。赤霉素的合成受古巴焦磷酸合成酶（copalyl pyrophosphate synthase，CPS）、內根-貝殼杉烯合成酶（ent-kaurene synthase，KS）、內根-貝殼杉烯19-氧化酶（ent-kaurene oxidase，KO）、GA-20-氧化酶（gibberellin- 20-oxidase，GA20ox）及GA-3-氧化酶（gibberellin-3- oxidase，GA3ox）等多個酶統(tǒng)一調控[8]。在擬南芥中，（CPS突變體）[9]、（KS突變體）[10]、（KO突變體）[11]均出現矮化現象。水稻赤霉素合成基因[12]、（）[13]及（）[1]突變也會使水稻出現不同程度的矮化。一般情況下，赤霉素合成突變體除了株高會發(fā)生變化之外，另外一個特征是對外源GA敏感。而水稻[14]和[15]突變體均對外源GA不敏感，表明GID1（赤霉素特異性受體）和SLR1（DELLA蛋白）參與植物體內赤霉素信號的轉導。相關研究表明，當細胞外GA濃度較低時，GID1不與GA結合，其N端結構域（N-Ex）呈疏松狀態(tài)，使DELLA蛋白與GA早期應答基因結合，并通過抑制應答基因的翻譯過程進而使其失活。當細胞外GA濃度較高時，GA誘導GID1構象發(fā)生變化，并與其結合形成GA-GID1復合物。該復合物具有疏水性的表面以便與DELLA蛋白形成三聚體，促進DELLA與泛素E3連接酶復合體結合，誘導DELLA蛋白被26s蛋白酶降解，進而GA信號得以釋放[16]。矮化突變體除了株高變矮之外，通常還伴隨著花發(fā)育異常和分蘗增多等現象。尹昌喜[17]研究表明下調表達及上調表達導致穗莖節(jié)間GA1含量減少是水稻出現半矮化和包穗的原因。而張玲[18]和WANG等[19]分別利用圖位克隆和BSA鑒定了新的基因和，這兩個基因的突變均能導致水稻半矮化且花發(fā)育異常。獨腳金內酯（strigolactone，SL）是一組類胡蘿卜素衍生的內酯，擬南芥多叢枝突變體[20]及水稻多分蘗突變體[21]均證實了SL在抑制腋芽生長方面具有保守作用。【本研究切入點】筆者在轉基因水稻中獲得穩(wěn)定遺傳的半矮化突變體，與已被鑒定的其他水稻矮化植株的表型有較大差異?！緮M解決的關鍵問題】本研究利用轉錄組學及生物信息學分析確定造成突變體表型異常的主要基因，并利用高效液相色譜-質譜聯(lián)儀對突變體內的激素進行檢測，與轉錄組測序結果相互驗證。矮化成因的解析對克服過度矮化障礙因子及培育抗倒伏高產水稻品種具有理論與應用價值。

1 材料與方法

1.1 突變體材料

在水稻日本品種Kitaake（）幼胚組培過程中，獲得一株半矮化突變體，通過網室自然條件下土壤培養(yǎng)3代之后，未出現性狀分離，表型穩(wěn)定，突變體用（13）表示。

1.2 突變體表型分析

挑選發(fā)育飽滿的野生型和突變體種子于玻璃培養(yǎng)皿中，自來水浸泡，置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中暗發(fā)芽1 d。第2天用濕潤的濾紙代替自來水繼續(xù)培養(yǎng)，第4天轉移到光照培養(yǎng)箱中，光照條件為白天16 h 28℃/黑夜8 h 22℃。第5天轉移到土壤中，水稻土和蛭石比例為2﹕1，培養(yǎng)白盆的尺寸54 cm×35 cm×12 cm（長×寬×高），土壤重量為4 kg，每天上午和下午各澆一次水。培養(yǎng)地點是中國農業(yè)科學院資源區(qū)劃所東區(qū)網室。

在水稻生長至抽穗期時，用直尺量取地上部高度（5次生物學重復）。選取5株水稻進行有效分蘗數統(tǒng)計。利用立體式顯微鏡（LECIA M165 FC，德國）觀察水稻小穗及花內部構造的差異。小穗采自穗的同一位置，然后用鑷子將外稃和內稃分開露出雄蕊和雌蕊。選取穗莖節(jié)間的莖，用刀片刮至莖透明為止，刮的時候需滴兩滴蒸餾水以確保莖保持濕潤，然后利用光學顯微鏡（LEICA DM6 B，德國）觀察細胞大小，并統(tǒng)計30個細胞的長度。在水稻成熟之后，選取10株統(tǒng)計其結實率。然后用游標卡尺測量種子長和寬，重復6次。

1.3 轉錄組測序

對苗期生長3周的水稻進行外源GA處理，噴施20 ml濃度為1.5×10-4mol·L-1的GA3，3 d噴施1次，共3次，于噴施后第8天選取水稻第2片葉進行轉錄組測序，所有處理均按3次生物學重復進行。首先用Easy Pure Plant RNA（北京全式金）試劑盒提取RNA，然后用帶有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA，加入fragmentation buffer將mRNA打斷成短片段，隨后，用六堿基隨機引物（random hexamers）以mRNA為模板進行反轉錄合成一鏈cDNA，再加入緩沖液、dNTPs和DNA聚合酶Ⅰ合成二鏈cDNA。其次利用AMPure XP beads純化雙鏈cDNA，對純化后的雙鏈cDNA進行末端修復、加A、加接頭。通過AMPure XP beads對雙鏈cDNA進行片段大小選擇，最后進行PCR擴增以構建cDNA文庫。使用Agilent 2100對文庫的插入片段大小進行檢測，文庫質檢合格后，利用Illumina高通量測序平臺進行測序。

使用DEseq和DEseq2檢測轉基因與野生型株系之間的差異表達基因，差異基因篩選的條件為：差異倍數≥2和Q值（或FDR）≤0.01。然后使用Gene Ontology（GO富集）[22]和KEGG富集[23]對差異基因進行分析。

1.4 突變體外源GA敏感性檢測

土培水稻外源噴施GA處理與轉錄組測序的水稻一致，在轉錄組測序取樣之前，觀察并記錄表型差異。水培水稻外源GA處理是待水稻在恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)芽3 d后，進行水培，營養(yǎng)液（Hoagland，pH5.8）3 d更換1次，并在營養(yǎng)液中分別添加濃度為1.5×10-4、3×10-5和6×10-6mol·L-1的GA3，10 d后，觀察突變體的表型。

1.5 qRT-PCR分析

待水稻生長至孕穗期，進行外源GA處理，與轉錄組測序取樣之前的處理方式相同，之后選取花、穗莖節(jié)間的莖及第2片葉提取RNA。首選用液氮進行研磨，之后用Easy Pure Plant RNA試劑盒（北京全式金）進行RNA提取。將提取后的RNA用濃度測定儀（Nanodrop 2000，美國）測定其濃度。利用反轉錄試劑盒Transscript One-step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（北京全式金）將1.5 μg RNA反轉錄為cDNA。使用ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix（南京諾唯贊）進行熒光定量PCR，總反應溶液體積為20 μL，包括10 μL 2×ChamQTM Universal SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL正反引物（表1）、2 μL cDNA模板和7.2 μL無RNA酶水，重復3次。使用ABI 7500（美國）熒光定量PCR儀進行定量PCR擴增，PCR擴增條件為94℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 30 s，40個循環(huán)。以作為內參，擴增結束后使用2-ΔΔCt公式計算相對表達量。

表1 熒光定量PCR引物

1.6 赤霉素含量檢測

1.6.1 赤霉素的提取 稱取新鮮水稻葉片約1 g于液氮中研磨粉碎，加入10 ml異丙醇/鹽酸提取緩沖液和8 μl 1 μg·mL-1內標溶液，4℃震蕩30 min；隨后加入20 ml二氯甲烷，4℃震蕩30 min；之后13 000 r/min（4℃）離心5 min，取下層有機相，避光用氮吹儀（杭州美歐）吹干有機相，用400 μl甲醇（0.1%甲酸）溶解，0.22 μm濾膜過濾，最后用高效液相色譜（Aglient1290，美國Aglient）-質譜（SCIEX-6500Qtrap，美國AB）聯(lián)儀檢測。

1.6.2 標準曲線繪制 以甲醇（0.1%甲酸）為溶劑配制梯度為0.1、0.2、0.5、2.0、5.0、20.0、50.0和200.0 ng·mL-1的GA1和GA4標準溶液，并加入終濃度為20.0 ng·mL-1的內標溶液。每個濃度2個重復。

1.6.3 液相和質譜條件 液相條件：色譜柱采用poroshell 120 SB-C18反相色譜柱（2.1 mm×150 mm，2.7 μm）；柱溫：30℃；流動相：A﹕B=（甲醇/0.1%甲酸）﹕（水/0.1%甲酸）；洗脫梯度：0—1 min，A=20%；1—9 min，A遞增至80%；9—10 min，A=80%；10—10.1 min，A遞減至20%；10.1—15min，A=20%；進樣體積：2 μl。

質譜條件：氣簾氣為15 psi；噴霧電壓：4 500 v；霧化氣壓力：65 psi；輔助氣壓力：70 psi；霧化溫度：400℃。

1.7 統(tǒng)計分析

利用Excel 2010和SPSS 12.0軟件對實驗數據進行統(tǒng)計分析，用Duncan法進行差異顯著性檢驗。

2 結果

2.1 半矮化突變體sd13的表型差異

水稻半矮化突變體的表型發(fā)育異常。與野生型相比，突變體株高變矮且分蘗數增多（圖1-A）并出現包穗現象，穗不能完全伸出劍葉鞘（圖1-B和圖1-C）；突變體種子變?。▓D1-D）且小穗發(fā)育異常，外稃與內稃上的表皮毛消失（圖2-A和圖2-C）；花發(fā)育延遲，雄蕊變?。▓D2-E和圖2-G）；莖節(jié)間細胞長度減?。▓D3）。統(tǒng)計分析顯示突變體株高減少56.29%，且各個節(jié)間長度均減小（圖4-A），差異極顯著；突變體有效分蘗數比WT高出47.44%（圖4-B），方差分析差異極顯著；突變體結實率低，僅為WT的12.62%（圖4-C）；種子長度和寬度均減小，經方差分析差異顯著（＜0.05）（圖4-D和圖4-E）。利用顯微鏡對突變體的莖縱切片統(tǒng)計分析，發(fā)現突變體的細胞長度減少約23%，差異極顯著（＜0.01）（圖4-F）。

2.2 突變體對外源GA敏感性檢測

為了深入探究突變體遺傳突變的分子應答與赤霉素合成基因之間是否存在依存關系，對水稻進行外源噴施GA3處理，結果表明，經赤霉素處理的突變體的株高、分蘗、包穗、結實率、種子大小、表皮毛和莖細胞長度均得到一定程度的恢復（圖2-C和圖2-D，圖4-B—圖4-F，圖5-A）。與噴施GA3前相比，野生型和突變體在噴施GA3之后，有效分蘗數均減小，差異均達顯著水平。噴施GA3后，與野生型相比，雖然突變體結實率差異仍然極顯著，但是與噴施GA3之前相比顯著增高（＜0.01）。種子的長與寬在噴施GA3后均得到一定程度的恢復，但是與噴施GA前差異不明顯。在噴施GA3后，突變體表皮毛出現了一定的恢復，但是沒有測試具體數量指標。突變體在噴施GA3后，其莖細胞長度顯著變長（＜0.01）。水培的突變體經過GA3處理也出現相似的現象（圖5-B），結果顯示，在營養(yǎng)液中添加不同濃度GA3之后，突變體株高均增加，其中以低濃度處理（6×10-6mol·L-1）的突變體恢復最佳，說明突變體極有可能是GA敏感型突變體。

A：孕穗期野生型和突變體形態(tài)；B：野生型小穗（比例尺，2 cm）；C：突變體小穗（比例尺，2 cm）；D：野生型和突變體成熟種子大小

A—D：GA噴施前后野生型和突變體水稻小穗形態(tài)（比例尺，0.4 mm）；E—H：GA噴施前后野生型和突變體水稻花的特征（比例尺，0.4 mm）

圖3 噴施GA3前后野生型和突變體水稻穗莖節(jié)間莖細胞大小（比例尺，25 μm）

**代表差異極顯著，P＜0.01；*代表差異顯著，P＜0.05。下同

A：土培突變體噴施GA后的表型變化；B：營養(yǎng)液添加不同濃度GA后突變體表型變化，GA①、GA②和GA③分別代表GA3濃度為1.5×10-4、3.0×10-5和6.0×10-6 mol·L-1

2.3 基于轉錄組學分析的差異基因表達特征

為了深入探究遺傳突變的分子機制，將培養(yǎng)3周的水稻進行轉錄組測序。測序結果顯示，與WT相比，突變體共有631個差異基因，其中326個上調，305個下調（圖6-B）。GO（Gene Ontology）富集顯示，差異基因主要富集在電子轉移過程，涉及電子轉移的基因有50個（圖6-C）。KEGG（Kyoto Encyclopedia of genes and genomes）富集顯示差異基因主要參與糖酵解和磷酸戊糖等代謝途徑（圖6-D）。說明半矮化突變體的某一個或者多個基因突變導致了下游參與電子轉移基因的異常表達，異常表達的基因極有可能是一些與糖代謝有關的活性酶。

A：差異基因聚類圖。每一行表示一個基因，每一列表示一個樣，顏色從紅到藍，表示表達水平從大到小，顏色相近聚類區(qū)內的基因表達模式相近，說明這些基因可能具有相似的功能或參與調控同一條代謝通路；B：差異基因火山圖。差異表達顯著的基因用紅點（上調）和綠點（下調）表示，差異表達不顯著的基因用藍點表示；C：差異基因GO富集圖。綠色代表生物過程，橙色代表分子功能；D：差異基因KEGG富集散點圖。點的大小表示此pathway中差異表達基因個數多少，而點的顏色對應于不同的Qvalue值，值越小說明富集越顯著

A: Differential gene clustering. Each row represents a gene and each column represents a sample. The color is from red to blue, indicating that the expression level is from large to small, and the expression patterns of genes in similar clusters are similar, indicating that these genes may have similar functions or participate in regulation of the same metabolic pathway; B: Differential gene volcano map. Genes with significant differential expression are indicated by red dot (up-regulation) and green dot (down-regulation), and genes with insignificant differential expression are represented by blue dots; C: Differential gene GO enrichment map. Green represents biological processes and orange represents molecular function; D: Differential gene KEGG enrichment scatter plot. The size of the dot indicates the number of differentially expressed genes in the pathway, and the color of the dot corresponds to a different Qvalue. The smaller the value, the more significant the enrichment

圖6 轉錄組測序結果

Fig. 6 Transcriptome sequencing results

為進一步分析挖掘差異表達基因的累積分布特征，對突變體中噴施GA前后得到的8個表達不一致的差異基因進行了分析（表2），結果表明，這8個差異基因對外源GA較為敏感。利用生物信息學分析，發(fā)現有一個與赤霉素合成相關的，在突變體中表達明顯上調，而噴施GA后表達出現下調。在植物體內負責將GA12轉化為GA53，而GA12和GA53又分別轉化為GA4和GA1，GA4的活性強于GA1，暗示半矮化突變體極有可能是表達異常引起的。對突變體的花、莖和葉提取RNA進行qRT-PCR驗證，結果（圖7）顯示，在突變體各器官中的表達均高于野生型，尤其在莖中的表達量較高且與WT相比差異極顯著；在突變體葉中的表達量也較高，與WT相比差異極顯著；但在花中的差異不明顯。對突變體進行GA處理之后，的表達量出現不同程度的下降，其中在莖和葉中與噴施GA之前相比差異極顯著。說明突變體是由表達異常引起的，且對外源GA敏感。

表2 突變體噴施GA前后表達相反的基因

所有基因功能均查閱自Uniprot蛋白數據庫及相關文獻，下同

All gene functions are reviewed from the UniProt database and related paper, the same below

2.4 水稻突變體GA的富集特征

為明確突變體中表達上調是否引起水稻中GA4含量變化，用高效液相和質譜聯(lián)儀對突變體中的GA1和GA4進行檢測分析。結果表明，與WT相比，突變體中的GA1含量無顯著變化，但活性更強的GA4減少了94.9%（圖8），差異極顯著（＜0.01），與預測結果一致，說明半矮化突變體是由GA4減少引起的。

圖7 OsGA13ox在突變體各器官中的相對表達量

A：野生型水稻GA4檢測峰圖；B：突變體水稻GA4檢測峰圖；C：野生型和突變體水稻中GA1含量；D：野生型和突變體水稻中GA4含量

2.5 GA對水稻分蘗的影響

赤霉素（GA）和獨腳金內酯（SL）通常參與調控植物的枝條分枝或分蘗[25]，并且GA和SL之間存在著競爭DELLA蛋白結合位點的關系[26]。轉錄組測序分析韋恩圖顯示，野生型和突變體有12個共同對GA應答的基因（圖9-A），利用GO注釋獲得這12個基因的功能（表3）。有趣的是，最后3個基因、和在突變體中也下調表達。是D14蛋白，作為獨腳金內酯（SL）的特異性受體，可與赤霉素受體GID1競爭DELLA蛋白結合位點，調控植物的生長發(fā)育[27]。qRT-PCR結果顯示（圖9-B），與野生型相比，在突變體中下調表達，差異極顯著。野生型和突變體噴施GA后，均上調表達，其中野生型上調表達較高，差異極顯著（＜0.01），而突變體中雖然也出現了上調表達，但與噴施GA之前相比，差異不顯著。

表3 野生型和突變體共表達的12個GA應答基因

圖9 差異基因韋恩圖及D14在野生型和突變體莖中的相對表達量

3 討論

3.1 OsGA13ox異常表達使GA4含量減少是突變體半矮化的原因

許多研究表明水稻的矮化及半矮化與赤霉素合成或信號轉導受阻有關，Itoh等[29]研究表明水稻突變是突變體矮化的原因，而Lo等[30]發(fā)現超表達水稻也會出現矮化等現象。這些現象產生的原因是GA3ox氧化酶是控制合成GA1和GA4的關鍵因子，而GA2ox氧化酶可以使GAs鈍化失活[31]。本研究發(fā)現一株半矮化突變體，其株高變矮，分蘗增多，且花發(fā)育異常，結實率低。該突變體對外源GA敏感，并且噴施GA3能使表型得到一定程度的恢復，說明該突變體為功能缺失型突變體。赤霉素的合成主要受內根-貝殼杉烯合成酶（KS）、內根-貝殼杉烯19-氧化酶（KO）、GA-13-羥化酶（GA13ox）及GA-20-氧化酶（GA20ox）等酶的統(tǒng)一調控（圖10）。已有研究表明，在擬南芥[32-33]和水稻[34]中，GA1的生物活性低于GA4，而GA13ox作為調控GA4和GA1的樞紐，對植物體內赤霉素的相對穩(wěn)定具有十分重要的作用。MAGOME等[24]發(fā)現在水稻中超表達可導致水稻半矮化，而GA13突變體卻表現出植株增高，穗莖節(jié)間變長。造成這種現象的原因是超表達致使活性更高的GA4富集減少，突變體則相反，由此可說明在控制植物體內GA4和GA1的相對穩(wěn)定發(fā)揮著重要的作用。本研究轉錄組測序和qRT-PCR結果顯示，與WT相比，半矮化突變體表達上調，使活性更高的GA4含量減少，破壞GA4和GA1之間的相對平衡，這與前人研究結論相似，再次證明了GA13ox對植物體內赤霉素的相對平衡是至關重要的。

3.2 sd13的突變基因可能是能夠抑制OsGA13ox基因表達的轉錄因子

通常基因的轉錄水平受轉錄因子的調節(jié)，Zhang等[35]研究發(fā)現水稻轉錄因子OsWRKY71是赤霉素信號轉導的抑制子，而OsGAMYB是GA誘導型轉錄激活因子，其啟動子中含有W盒功能性保守基序TGAC，OsWRKY71可以與該基序特異性結合而抑制OsGAMYB的激活，導致GA信號的轉導受到阻礙。Zhang等[36]又發(fā)現也可以抑制赤霉素信號的轉導。Guo等[37]研究表明擬南芥是編碼具有抑制活性的含B3結構域的轉錄因子，突變體致使擬南芥出現矮化等現象，同時發(fā)現赤霉素（GA）失活基因的表達顯著增加；并且驗證了突變體中、和3種GA生物合成基因表達減少，導致內源GA4富集明顯降低。外源GA處理不僅可以誘導擬南芥表達，而且能夠部分緩解突變體的矮化程度，說明能夠抑制植物體內赤霉素失活基因的表達。因此，推測本研究中的異常表達可能與具有抑制活性的轉錄因子突變有關。利用植物轉錄因子數據庫（http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn）對轉錄起始位點前500位和后100位啟動子序列進行基序預測，結果如表4所示。除此之外，據報道，茉莉酸（JA）可以通過強烈抑制和的轉錄拮抗GA的合成[38]，說明高水平JA可能拮抗莖中GA的生物合成。所以與相關的轉錄因子是否突變有待于進一步深入研究，并且探索茉莉酸合成基因或其他基因是否與的異常表達有關。

圖10 植物體內赤霉素合成途徑[31]

表4 OsGA13ox啟動子序列中的基序預測結果

3.3 GA可能通過調控D14的表達間接調控水稻分蘗

擬南芥突變體擁有更多的分枝，超表達的水稻也表現出分蘗增多[30]，而水稻突變體中赤霉素合成基因上調表達使得分蘗減少[47]，說明GA能夠抑制水稻分蘗。Ito等[25]已證明外源GA能夠使水稻分蘗異常突變體得到恢復。除赤霉素之外，獨腳金內酯（SL）也能夠抑制枝條分枝或者分蘗[48]，且SL的合成受GA信號調控[49]。D14蛋白為SL的特異性受體，二者能夠和DELLA蛋白結合形成復合物，從而調控下游基因的表達，間接調節(jié)枝條分枝或者分蘗。本研究發(fā)現，與WT相比，突變體的下調表達，而作為SL的特異性受體，下調表達會使SL信號減弱，從而使分蘗增多，這與突變體的分蘗增多相符合。外源噴施GA使上調表達，會增強SL信號從而使分蘗減少，而WT噴施GA后分蘗減少也驗證了這一猜測。本研究推測GA可能通過的表達間接調控植物體的枝條分枝或分蘗。

4 結論

半矮化突變體是由異常表達導致GA4富集減少引起的；赤霉素可能通過間接調控水稻的分蘗。

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Enrichment profile of GA4 is an important regulatory factor triggering rice dwarf

HUANG ShengCai1, WANG Bing1, XIE GuoQiang2, LIU ZhongLai2, ZHANG MeiJuan1, ZhANG ShuQing1, CHENG XianGuo1

(1Intitute of Agricultural Resources and Regional Planning, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081;2Jiu Jiang Academy of Agricultural Sciences, Jiujiang 332101, Jiangxi)

【Objective】A dwarf rice mutant was generated by culturing rice embryo tissues and characterized to elucidate the reasons for leading to an occurence of semi-dwarf rice with more tiller number. It is expected that this study will provide a theoretical basis for scientifically cultivating rice varieties of lodging-resistant and high-yielding in overcoming the dwarf obstacle factors.【Method】In this study, both the rice dwarf mutant and wild type were phenotypically profiled, and the structural characteristics of flower and cell appearance of leaves were investigated by stereomicroscope and light microscopy; The differential gene expression profiles were analyzed by both the transcriptomics and qRT-PCR, and the sensitivity of the mutant to exogenous gibberellin was detected by spraying exogenous GA3; The enrichment profiles of gibberellin in the mutant were detected by a high performance liquid chromatography and a mass spectrometry. 【Result】Data showed that the mutant demonstrated a decrease of 56.59% in the average plant height and an increase of 47.44% in the effective tiller number compared with the wild type, respectively (＜0.01). Observation showed that the mutant led to disappearance of the epidermis and revealed a smaller stamen accompanying a delayed development in the flower organs. Although the mutant has a higher effective tiller number, but significantly lowers the seed setting rate, which only accounts for 12.62% of that in the wild type. The length and the width of grains also are significantly reduced (＜0.01). Stem longitudinal sections reveal that the mutant decreased the cell length of 23% compared with the wild type (＜0.01). However, when the mutant was exposed to exogenous gibberellin, the plant height, effective tiller number, seed setting rate, seed size, epidermis and the stem cell length were obviously restored, indicating that the dwarf mutant possibly results from the shortage of GA’s synthesis in plant. Transcriptome sequencing showed that the mutant significantly up-regulated thegene, and exhibited an identical result with the qRT-PCR analyses. Since theOsGA13oxcontrols the conversion of the GA12 to the GA53, both of which are converted to the GA4 and the GA1, respectively. Particularly, the GA4 exhibits a higher activity than the GA1, suggesting that rice dwarf might be triggered by the reduction of GA4 enrichment in plant. Measurement confirmed that the accumulation of the GA4 in the mutant was decreased by 94.9% compared with the wild type. Additionally, as a specific receptor for SL (Strigolactone), thegene is involved in the SL signaling transduction in plant, and thus inhibits branching or tillering. The qRT-PCR showed that the mutant significantly down-regulated thegene compared to the wild type, however, both the wild type and the mutant significantly up-regulated after spraying GA3. The data suggested that the up-regulation of thegene might lower the effective tiller number, while the down-regulation of thegene possibly increase the effective tiller number. Statistical analyses demonstrates that the mutant significantly increased the effective tiller number, but both the wild type and mutant decreased the effective tiller number after spraying GA3, indicating that the expression profiles of thegene in rice might be modulated by GA, and thereby exert on the tiller number.【Conclusion】Semi-dwarfed rice mutant is likely caused by a decrease of GA4 enrichment because of abnormal expression of thegene, and GA might indirectly regulate rice tiller by affecting the expression of thegene

rice; semi-dwarf mutant;; GA4;; effective tiller

10.3864/j.issn.0578-1752.2019.05.002

2018-11-06；

2018-12-09

轉基因重大專項（2016ZX08010005-9）

黃升財，E-mail：huangshengcai_123@163.com。 通信作者張樹清，E-mail：zhangshuqing@caas.cn。通信作者程憲國，Tel：010-82105031；E-mail：chengxianguo@caas.cn

（責任編輯 李莉）