李一蘭 周曉溪 姚羽 田方 張玲變 秦愛方

(山西省食品藥品檢驗(yàn)所，太原 030001)

注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉為氨芐西林鈉和氯唑西林鈉等量混合的無菌粉針劑，即對(duì)革蘭陽性菌和陰性菌有廣譜殺滅作用，又對(duì)耐青霉素的金黃色葡萄球菌有效[1-2]，適用于敏感菌所致的呼吸道感染、胃腸道感染、尿路感染、軟組織感染、心內(nèi)膜炎、腦膜炎、敗血癥等，也可用于化膿性鏈球菌或肺炎球菌與耐青霉素葡萄球菌所致的混合感染。注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉均由無菌原料藥直接分裝而成，規(guī)格為0.5g、1.0g、1.5g和2.0g。

注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉為2016年國(guó)家評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)品種，此次抽驗(yàn)的目的在于客觀地評(píng)價(jià)國(guó)內(nèi)藥品的質(zhì)量現(xiàn)狀；客觀分析產(chǎn)品存在的主要質(zhì)量問題，進(jìn)而為進(jìn)一步提高產(chǎn)品質(zhì)量指明方向[3-5]。氨芐西林鈉有溶媒結(jié)晶、冷凍干燥、噴霧干燥3種生產(chǎn)工藝[6]。氯唑西林鈉為溶媒結(jié)晶生產(chǎn)工藝。依據(jù)氨芐西林鈉原料的生產(chǎn)工藝，本次評(píng)價(jià)樣品可分為兩種：溶媒結(jié)晶氨芐西林鈉樣品與冷凍干燥氨芐西林鈉樣品，分別簡(jiǎn)稱為結(jié)晶氨芐樣品與凍干氨芐樣品。本文對(duì)國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上的注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉依據(jù)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)并進(jìn)行探索性研究，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)及探索檢驗(yàn)結(jié)果對(duì)質(zhì)量進(jìn)行系統(tǒng)地分析，從而對(duì)現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提出合理的改進(jìn)建議，為注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的進(jìn)一步完善和今后的監(jiān)督管理提供重要依據(jù)[7-8]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters E2695高效液相色譜儀；Mettler AE240電子天平； Mettler Toledo SevenMulti酸度計(jì)；Mettler Toledo DL38水分滴定儀；溫控水分活度儀(Novasina，Awsprint)；Ultimate 3000 高效液相色譜儀系列；Thermo Scientific公司Q ExactiveFocusTM組合型四極桿OrbitrapTM質(zhì)譜儀。

1.2 試藥

氨芐西林對(duì)照品：批號(hào)130410-201207，含量86.5%；氯唑西林對(duì)照品：批號(hào)130423-200903，含量91.0%；氨芐西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品：批號(hào)130618-201202；均購自中國(guó)食品藥品檢定研究院。45批次注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉為2016年國(guó)家藥品評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)樣品(其中凍干氨芐樣品43批次，結(jié)晶氨芐樣品2批次)，另有2批次結(jié)晶氨芐樣品為調(diào)研樣品，分別抽自國(guó)內(nèi)6家生產(chǎn)企業(yè)。水為自制超純水，乙腈為Dikma公司生產(chǎn)的色譜純，其余所用試劑均為分析純。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 法定檢驗(yàn)

本次抽驗(yàn)的樣品按照國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)化學(xué)藥品地方標(biāo)準(zhǔn)上升國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)第七冊(cè)[9]進(jìn)行檢驗(yàn)。主要檢驗(yàn)項(xiàng)目為水分、有關(guān)物質(zhì)、含量測(cè)定等。

2.2 探索性研究

根據(jù)法定檢驗(yàn)結(jié)果，結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)道[8,10-11]以及品種特點(diǎn)、專題調(diào)研等情況，重點(diǎn)開展晶型、水分與水活度、有關(guān)物質(zhì)等項(xiàng)目的探索性研究。

2.2.1 晶型測(cè)定

選取不同生產(chǎn)工藝樣品及原料，采用粉末X-射線衍射測(cè)定晶型。

2.2.2 水分與水活度

分別將不同生產(chǎn)工藝的樣品各2批次置于相對(duì)濕度75%的環(huán)境中，開蓋放置，取樣時(shí)間為間隔2h，分別選用水分測(cè)定儀和溫控水分活度儀測(cè)定其水分和25℃水活度。

管道輸水灌溉和滴灌的單井控制面積應(yīng)根據(jù)公式（1）計(jì)算，并結(jié)合片區(qū)的空間分布確定，原則上采用的單井控制灌溉面積不小于計(jì)算值的10畝。噴灌工程的單井控制面積的確定還應(yīng)結(jié)合噴灌機(jī)的選型確定。審查中要嚴(yán)格控制單井控制面積，一方面盡量少打井減少投資，另一方面可促進(jìn)節(jié)水，避免水資源的浪費(fèi)。

2.2.3 有關(guān)物質(zhì)

(1)有關(guān)物質(zhì)測(cè)定：現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)采用等度洗脫法，不能有效分離雜質(zhì)，參照2015年版中國(guó)藥典二部[12]氨芐西林鈉方法建立本品有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫法：采用十八烷基硅烷鍵合硅膠(4.6mm×250mm, 5μm)為填充劑；流動(dòng)相A為12%乙酸溶液-0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈-水(0.5:50:50:900, V/V/V/V)；流動(dòng)相B為12%乙酸溶液-0.2mol/L磷酸二氫鉀溶液-乙腈-水(0.5:50:400:550, V/V/V/V)；檢測(cè)波長(zhǎng)為254nm。先以流動(dòng)相A-流動(dòng)相B(85:15, V/V)等度洗脫，待氨芐西林峰洗脫完畢后立即按表1進(jìn)行線性梯度洗脫。

(2)雜質(zhì)的確證：通過UPLC-MS切換技術(shù)在線脫鹽，一維色譜條件參照有關(guān)物質(zhì)測(cè)定，二維色譜條件為色譜柱AcclaimTMPolar Advantage ⅡC18(4.6mm×50mm, 3μm)；流速: 0.5mL/min；柱溫:30℃；流動(dòng)相為水:乙腈=80:20(V/V)。利用質(zhì)譜進(jìn)行雜質(zhì)一級(jí)和二級(jí)掃描：根據(jù)二維上的出峰時(shí)間，設(shè)置質(zhì)譜閥切換參數(shù)，進(jìn)行一級(jí)和二級(jí)掃描。質(zhì)譜條件：鞘氣流速：40L/min；輔氣流速：5L/min；反吹氣流速：1L/min；噴霧電壓：3.5kv；毛細(xì)管溫度：320℃；輔氣加熱溫度：400℃；全掃描：分辨率：35000；掃描范圍：200-2000。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Linear gradient elution program

2.2.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

分別將不同生產(chǎn)工藝樣品進(jìn)行加速試驗(yàn)，在40℃條件下分別放置10、20和30d，對(duì)溶液的澄清度與顏色、含量、有關(guān)物質(zhì)等進(jìn)行測(cè)定。

3 結(jié)果與討論

3.1 法定檢驗(yàn)結(jié)果

47批次樣品按現(xiàn)行藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)均符合規(guī)定，合格率為100%。水分、有關(guān)物質(zhì)等主要檢查項(xiàng)目與產(chǎn)品質(zhì)量密切相關(guān)，因此對(duì)其結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

3.1.1 水分

對(duì)47批次樣品的水分?jǐn)?shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)晶氨芐樣品為1.98%～2.02%，凍干氨芐樣品為2.35%～2.64%，結(jié)晶氨芐樣品水分低于凍干氨芐樣品。

3.1.2 有關(guān)物質(zhì)

對(duì)47批次樣品的總雜質(zhì)數(shù)據(jù)(等度洗脫)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)晶氨芐樣品總雜質(zhì)量為0.54%～0.63%，凍干氨芐樣品總雜質(zhì)量為1.34%～2.07%，結(jié)晶氨芐樣品總雜質(zhì)量低于凍干氨芐樣品。

3.2 探索性研究

3.2.1 晶型測(cè)定

結(jié)晶氨芐西林鈉原料具有多個(gè)特征衍射峰為結(jié)晶型粉末，凍干氨芐西林鈉原料無特征衍射峰出現(xiàn)為無定型粉末；氯唑西林鈉原料為結(jié)晶型粉末。結(jié)晶氨芐樣品均具有相應(yīng)特征衍射峰，凍干氨芐樣品僅呈現(xiàn)氯唑西林鈉特征衍射峰(圖1)。

3.2.2 水分與水活度

圖1 粉末X-射線衍射圖Fig.1 Powder X-ray diffraction

凍干氨芐樣品與結(jié)晶氨芐樣品8h水活度和水分平均上升率均存在一定差異，結(jié)晶氨芐樣品8h水分平均增長(zhǎng)率1.15%/h，水活度平均增長(zhǎng)率0.034/h；凍干氨芐樣品8h水分平均增長(zhǎng)率1.22%/h，水活度平均增長(zhǎng)率0.056/h；凍干氨芐樣品初始水活度明顯低于結(jié)晶氨芐樣品，8h時(shí)其水活度與結(jié)晶氨芐樣品一致，其增長(zhǎng)速率高于結(jié)晶氨芐樣品(圖2)；一般認(rèn)為樣品在水活度越小時(shí)質(zhì)量越穩(wěn)定，本次試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，初始水活度低的凍干氨芐樣品穩(wěn)定性次于初始水活度高的結(jié)晶氨芐樣品，提示晶型對(duì)本品質(zhì)量的影響大于水活度的影響[13]。

圖2 不同生產(chǎn)工藝樣品水活度及水分測(cè)定結(jié)果比較圖Fig.2 The comparison of water activity and water determination results in samples of different production processes

3.2.3 有關(guān)物質(zhì)

為了能夠更好地反映樣品的雜質(zhì)譜，對(duì)現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的有關(guān)物質(zhì)測(cè)定方法進(jìn)行改進(jìn)，建立了洗脫能力更強(qiáng)，分離效果更好的梯度洗脫法，與現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)的等度洗脫法(圖3)比較，其洗脫能力更強(qiáng)，檢出的雜質(zhì)總量更多(圖4)。47批次樣品雜質(zhì)個(gè)數(shù)和雜質(zhì)總量均明顯增加(雜質(zhì)總量增加了0.02%～1.67%)。

探索性研究結(jié)果表明，利用氨芐西林系統(tǒng)適用性對(duì)照品、氯唑西林雜質(zhì)對(duì)照品及通過UPLC-MS切換技術(shù)在線脫鹽實(shí)現(xiàn)磷酸鹽液相條件雜質(zhì)的定性，研究樣品16個(gè)雜質(zhì)(其中雜質(zhì)3、9、15、16由UPLCMS確證)并結(jié)合原料藥雜質(zhì)檢出情況和破壞性試驗(yàn)對(duì)雜質(zhì)結(jié)構(gòu)及來源進(jìn)行了歸屬(表2)。通過主成分自身對(duì)照法計(jì)算各雜質(zhì)含量，分析47批次樣品的雜質(zhì)檢出和分布情況(圖5)。圖5顯示不同生產(chǎn)工藝樣品均能檢出這9個(gè)雜質(zhì)，其中編號(hào)為1(氨芐西林噻唑酸)、5(氨芐西林閉環(huán)二聚體)、6(未知雜質(zhì)6)、9(氨芐西林閉環(huán)三聚體)、15(6-氨基青霉烷酸氯唑西林酰胺)、16(未知雜質(zhì)16)為主要雜質(zhì)，且各雜質(zhì)平均含量均大于0.1%；其中5號(hào)雜質(zhì)為凍干氨芐樣品最大單個(gè)雜質(zhì)，16號(hào)雜質(zhì)為結(jié)晶氨芐樣品最大單個(gè)雜質(zhì)[14-16]。

樣品生產(chǎn)工藝為無菌原料直接混合分裝，結(jié)合原料藥和制劑雜質(zhì)檢出情況，制劑的雜質(zhì)均與原料藥及其降解物一致，提示原料藥的質(zhì)量影響制劑質(zhì)量。

3.2.4 穩(wěn)定性考察

圖3 注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉有關(guān)物質(zhì)等度洗脫典型圖譜Fig.3 Isocratic elution program system HPLC chromatogram of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection in related substances

圖4 注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉有關(guān)物質(zhì)梯度洗脫典型圖譜Fig.4 Gradient elution program system HPLC chromatogram of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection in related substances

圖5 不同生產(chǎn)工藝樣品較大9個(gè)雜質(zhì)平均含量比較圖Fig.5 Thecomparisonof 9 impurities contents in ampicillin sodium and cloxacillin sodium

兩種生產(chǎn)工藝的樣品在40℃的條件下進(jìn)行加速試驗(yàn)[4]。比較樣品中的特定雜質(zhì)氨芐西林閉環(huán)二聚體，總雜質(zhì)、氨芐西林和氯唑西林純度變化，發(fā)現(xiàn)凍干氨芐樣品的閉環(huán)二聚體、總雜質(zhì)量均增加，氨芐西林純度降低，氯唑西林純度無明顯變化；結(jié)晶氨芐樣品閉環(huán)二聚體，總雜質(zhì)、氨芐西林和氯唑西林純度無明顯變化。提示凍干氨芐樣品受存儲(chǔ)溫度影響較大，在存儲(chǔ)過程中不穩(wěn)定。

3.2.5 相關(guān)分析

將47批次樣品的水分、氨芐西林閉環(huán)二聚體、雜質(zhì)總量、純度檢驗(yàn)結(jié)果和生產(chǎn)工藝類型等進(jìn)行多因素相關(guān)分析(見表3)表明：①不同氨芐西林鈉原料生產(chǎn)工藝與樣品的水分、氨芐西林閉環(huán)二聚體、雜質(zhì)總量、氨芐西林純度等均顯著相關(guān)(P＜0.01)，提示氨芐西林鈉原料的生產(chǎn)工藝是影響本品質(zhì)量的重要因素；②樣品的氨芐西林純度與水分、雜質(zhì)總量等均顯著相關(guān)，提示水分亦是影響樣品純度變化的主要原因。

表2 注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉雜質(zhì)的歸屬Tab.2 The impurity ascription of ampicillin sodium and cloxacillin sodium for injection

4 小結(jié)

本次評(píng)價(jià)性抽驗(yàn)結(jié)果顯示，注射用氨芐西林鈉氯唑西林鈉總體質(zhì)量較好，產(chǎn)品合格率100%，但現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需進(jìn)一步完善，建議采用梯度洗脫的方法進(jìn)行有關(guān)物質(zhì)檢查，并對(duì)氨芐西林閉環(huán)二聚體等特定雜質(zhì)進(jìn)行控制。探索性研究表明采用不同生產(chǎn)工藝氨芐西林鈉原料藥生產(chǎn)的樣品質(zhì)量存在明顯差異，凍干氨芐樣品質(zhì)量不及結(jié)晶氨芐樣品，且更易受溫度的影響，提示原料藥的質(zhì)量影響制劑質(zhì)量。因此，應(yīng)引導(dǎo)企業(yè)首選溶媒結(jié)晶工藝氨芐西林鈉原料。

表3 主要項(xiàng)目檢測(cè)結(jié)果多因素相關(guān)分析Tab.3 Multi-factors correlation analysis of the maior items determination results