范 銘，向 露，劉 哲，陸勝民，*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 食品科學(xué)研究所，浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品采后處理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310021； 2.浙江師范大學(xué) 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江 金華 321004)

桑葚屬于?？?，被列入藥食同源名錄，鮮果味道甜美、多汁，含有人體所必需的營(yíng)養(yǎng)素如維生素、氨基酸、礦物質(zhì)以及具有生理活性的花色苷、黃酮、酚酸類(lèi)化合物。大量研究表明，桑葚提取物在降血糖、增強(qiáng)免疫、降血脂、抗氧化、抗腫瘤等方面有顯著的作用[1-2]。目前，大多數(shù)關(guān)于桑葚的研究主要集中于其化學(xué)成分[3]、營(yíng)養(yǎng)成分[4]、藥理作用[5]以及桑葚產(chǎn)品(桑葚酒[6]、桑葚醋[7]、桑葚汁[8])等方面，但對(duì)桑葚中主要起降血糖功效的物質(zhì)提取工藝卻鮮見(jiàn)報(bào)道。本文主要采用超聲輔助水提取法優(yōu)化提取桑葚渣中對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶活性有抑制作用的物質(zhì)成分，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道桑葚水提液中槲皮素、花色苷以及多糖等物質(zhì)均有降血糖的作用[3]，這也為工業(yè)大規(guī)模提取桑葚渣中降糖功能因子提供科學(xué)依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

桑葚品種大十，采摘于浙江省安吉縣梅溪鎮(zhèn)馬村桑葚基地。榨汁后的桑葚渣以每袋500 g進(jìn)行分裝，保存于-20 ℃的冰箱中，備用。

1.2 儀器

DHG-9146A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)室備有限公司)；SCIENTZ-18N冷凍干燥機(jī)(寧波新芝生物科技股份有限公司)；BJ-300多功能粉碎機(jī)(拜杰公司)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；KQ-500DB型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；LXJ-ⅡB型離心機(jī)(上海安亭科學(xué)儀器廠(chǎng))；RE-52A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠(chǎng))；UV-1800紫外分光光度計(jì)(日本島津公司)。

1.3 試劑

可溶性淀粉、氯化鈉、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、碳酸鈉購(gòu)于上海國(guó)藥集團(tuán)；對(duì)硝基苯基-α-D葡萄糖吡喃苷(PNPG)購(gòu)于上海源葉生物科技有限公司；二甲基亞砜購(gòu)于上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶(豬胰腺淀粉酶)、α-葡萄糖苷酶均購(gòu)于Sigma公司。

1.4 方法

1.4.1 桑葚渣中降糖物質(zhì)提取

稱(chēng)取在-20 ℃中冷凍的桑葚渣(含水量89%)500 g平鋪于托盤(pán)中，鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重。干燥條件為50 ℃、48 h。將干燥后的桑葚渣打粉。稱(chēng)取干燥后的桑葚渣粉5 g，按預(yù)設(shè)的料液比加入去離子水，充分混勻后，置于預(yù)設(shè)的提取條件下進(jìn)行超聲提取，超聲提取結(jié)束后，放入涼水中冷卻，4 000 r·min-1離心10 min留取上清液，即得含有降糖因子的桑葚渣提取原液。將提取原液在50 ℃條件下減壓濃縮至一定體積，將其冷凍干燥(條件：阱溫度-40 ℃左右，真空度0.025 MPa，干燥72 h)后用蒸餾水配成一定的濃度。體外測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶、α-淀粉酶活性的抑制率，以此作為指標(biāo)研究提取液的降糖效果。

1.4.2 體外降糖指標(biāo)及其測(cè)定方法

α-葡萄糖苷酶活性抑制體系。通過(guò)抑制小腸上端α-葡萄糖苷酶的活性，阻礙直鏈或支鏈低聚糖單元如α-糊精、麥芽糖、麥芽三糖分解產(chǎn)生葡萄糖的過(guò)程，從而阻止葡萄糖吸收到血液中，限制胃腸道對(duì)食物中碳水化合物的吸收[9]。對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率大小可以作為體外判斷某種物質(zhì)抑制血糖能力的大小。

取10 mmol·L-1PNPG 100 μL，加入850 μL磷酸緩沖液(pH 6.8)，再加入樣品抑制劑， 37 ℃孵化10 min，加入酶50 μL(2 U·mL-1)，再孵化50 min，加入1 mL 1 mol·L-1的Na2CO3終止反應(yīng)后在405 nm測(cè)吸光度(表1)，并計(jì)算抑制率[10]?？瞻讓?duì)照為不加酶的反應(yīng)體系，以消除PNPG本身氧化產(chǎn)生對(duì)硝基苯酚(PNP)而影響測(cè)定結(jié)果，以拜糖平為陽(yáng)性對(duì)照[10]。

表1α-葡萄糖苷酶活性抑制體系

Table1Reaction system of α-glucosidase inhibitory activity

處理Treatmentα-葡萄糖苷酶α-glucosidase/μL抑制劑Inhibitor/μLPNPG/μL磷酸緩沖液pH 6.8Phosphate buffer pH 6.8/μL空白管Blank tube(A)50—100850空白對(duì)照Blank control(B)——100850抑制劑管Inhibitor tube(C)5025100850背景對(duì)照Background control(D)—25100850

α-淀粉酶活性抑制體系。抑制劑能通過(guò)抑制腸道內(nèi)唾液和α-胰淀粉酶的活性，阻礙食物中碳水化合物的消化吸收，可有效控制餐后血糖的升高，間接減少體內(nèi)脂肪的合成，延緩糖尿病的發(fā)生和發(fā)展[9]。

取50 μL α-淀粉酶(2 U·mL-1)和一定濃度的抑制劑25 μL，在37 ℃孵化10 min，加入0.75%可溶性淀粉1 mL，37 ℃反應(yīng)5 min，加入1 mL DNS試劑，沸水浴5 min，迅速水浴冷卻后用蒸餾水稀釋2.5倍，540 nm處測(cè)定吸光值，并計(jì)算抑制率[10]。反應(yīng)體系如表2。

1.4.3 單因素試驗(yàn)

分別以超聲功率200、300、350、400、500 W、超聲溫度30、40、50、60、70 ℃、超聲時(shí)間0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 h、料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)為影響因素，設(shè)置4個(gè)因素的不同水平，以確定相關(guān)因素對(duì)提取液中降糖因子含量的影響水平。

1.4.4 正交試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)，分析正交試驗(yàn)結(jié)果，確定桑葚渣中降糖因子的最佳提取工藝條件。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

所有試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2010、SPSS 17.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 料液比對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖1所示，桑葚渣水提液對(duì)α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，料液比為1∶40(g·mL-1)時(shí)，對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高為66.7%，而料液比為1∶30(g·mL-1)時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為69.1%，這可能是由于溶劑用量的增加可以增加固液接觸面積，提高擴(kuò)散速度，但隨著溶劑用量的增加，大量雜質(zhì)溶出，桑葚渣的酶抑制劑提取率降低[11]。所以對(duì)于α-淀粉酶而言，料液比選擇1∶30、1∶40、1∶50(g·mL-1)進(jìn)行正交試驗(yàn)，而對(duì)于α-葡萄糖苷酶而言，料液比選擇1∶20、1∶30、1∶40(g·mL-1)用于進(jìn)一步優(yōu)化。

表2α-淀粉酶活性抑制體系

Table2Reaction system of α-amylase inhibitory activity

處理Treatmentα-淀粉酶α-amylase/μL抑制劑Inhibitor/μL0.75%可溶性淀粉0.75% soluble starch/mLDNS/mL空白管Blank tube(A)50—11空白對(duì)照Blank control(B)——11抑制劑管Inhibitor tube(C)502511背景對(duì)照Background control(D)—2511

柱狀圖上無(wú)相同小寫(xiě)字母的表示各組間差異顯著(P<0.05)。下同。The different lowercase letters above the columns represented statistically significant differences among treatments (P<0.05). The same as below.圖1 料液比對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶抑制率的影響Fig.1 Effects of solid-liquid ratio on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase activities

2.1.2 超聲時(shí)間對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖2，當(dāng)超聲時(shí)間為1.5 h時(shí)，提取液對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為73.2%和75.9%，其趨勢(shì)都為先升高后降低。這可能體現(xiàn)了提取量隨時(shí)間延長(zhǎng)的積累效應(yīng)，但是過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的加熱提取也會(huì)使降糖因子遭到破壞[12]。故選擇時(shí)間為1.0、1.5、2.0 h用于進(jìn)一步優(yōu)化。

圖2 超聲時(shí)間對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.2 Effects of ultrasonic time on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.1.3 超聲溫度對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖3，當(dāng)超聲時(shí)間為60 ℃時(shí)，抑制劑對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶的抑制率最高，分別為64.2%和66.7%。這可能是由于隨著超聲溫度升高，分子動(dòng)能增加、運(yùn)動(dòng)速度加快，滲透、擴(kuò)散加快，使降糖物質(zhì)更易轉(zhuǎn)移到溶劑中的緣故。然而，當(dāng)溫度繼續(xù)升高，對(duì)酶的抑制效果下降，這可能與降糖物質(zhì)在高溫條件下被氧化破壞有關(guān)[13]。故選擇溫度為50、60、70 ℃用于進(jìn)一步優(yōu)化。

2.1.4 超聲功率對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響

如圖4，不同超聲功率提取的桑葚渣水提液對(duì)α-淀粉酶的抑制率先升高后降低，超聲功率為300 W時(shí)，對(duì)α-淀粉酶的抑制率最高為49.4%，而在超聲功率為350 W時(shí)，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率最高為53.9%，這是由于隨著超聲波功率的增大，提取液各分子動(dòng)能增加，超聲波的空穴效應(yīng)得到加強(qiáng)，使得降糖物質(zhì)的溶出速度加快。但隨著超聲功率的繼續(xù)增大，降糖效果又有所下降，這可能是因?yàn)槌暪β蔬^(guò)高，分子運(yùn)動(dòng)過(guò)于劇烈，加強(qiáng)了降糖物質(zhì)和其他成分之間的反應(yīng)而使其遭到破壞，導(dǎo)致降糖效果下降[9]。故對(duì)于α-淀粉酶而言，超聲功率選擇200、300、350 W進(jìn)行正交試驗(yàn)，而α-葡萄糖苷酶而言，超聲功率選擇300、350、400 W用于進(jìn)一步優(yōu)化。

圖3 超聲溫度對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.3 Effects of ultrasonic temperature on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

圖4 超聲功率對(duì)α-淀粉酶和α-葡萄糖苷酶活性抑制率的影響Fig.4 Effects of ultrasonic power on inhibition rate of α-amylase and α-glucosidase

2.2 正交試驗(yàn)

影響桑葚渣水提液降糖活性的因素不是孤立的，它們之間是相互關(guān)聯(lián)的?，F(xiàn)選擇超聲時(shí)間(A)、料液比(B)、超聲溫度(C)、超聲功率(D)4個(gè)因素進(jìn)行4因素3水平的正交試驗(yàn)，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶為指標(biāo)，確定最佳的工藝條件。正交試驗(yàn)各個(gè)因素水平設(shè)置見(jiàn)表3、表4。

以α-淀粉酶的抑制活性為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)對(duì)桑葚渣α-淀粉酶抑制劑提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表5，方差分析結(jié)果見(jiàn)表6。

正交試驗(yàn)結(jié)果如表5所示。影響α-淀粉酶的抑制活性的因素依次為超聲時(shí)間>料液比>超聲溫度>超聲功率，對(duì)α-淀粉酶的抑制活性最佳的提取條件為A2B2C3D2，即超聲時(shí)間1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超聲溫度70 ℃，超聲功率350 W。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得的桑葚水提液對(duì)α-淀粉酶的抑制率為78.6%。

表3以α-淀粉酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)因素水平表

Table3Orthogonal test factor table with alpha-amylase as index

水平LevelA超聲時(shí)間Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超聲溫度Ultrasonic temperature/℃D超聲功率Ultrasonic power/W11.01∶305030021.51∶406035032.01∶5070400

表4以α-葡萄糖苷酶為指標(biāo)的正交試驗(yàn)因素水平表

Table4Orthogonal test factor table with alpha-glucosidase as index

水平LevelA超聲時(shí)間Ultrasonic time/hB料液比Solid-liquidratio/(g·mL-1)C超聲溫度Ultrasonic temperature/℃D超聲功率Ultrasonic power/W11.01∶205020021.51∶306030032.01∶4070350

表5對(duì)α-淀粉酶的提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果表

Table5Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-amylase

試驗(yàn)號(hào)TestNo.ABCDα-淀粉酶抑制率Inhibition rate ofa-amylase/%1111155.702122260.653133356.284212366.715223170.456231264.507313248.808321350.519332145.33k157.5457.0755.9057.16k267.2259.5457.5657.98k347.2155.3758.5156.83R9.335.171.610.15

由表6的方差分析可知：在各個(gè)因素中，超聲時(shí)間對(duì)α-淀粉酶的抑制率的影響極顯著，料液比對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響比較顯著，而提取溫度、超聲功率對(duì)α-淀粉酶抑制率的影響不顯著。

以α-葡萄糖苷酶的抑制活性為指標(biāo)，用正交試驗(yàn)對(duì)桑葚渣α-葡萄糖苷酶抑制劑提取工藝條件進(jìn)行優(yōu)化，正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表7，方差分析結(jié)果見(jiàn)表8。

正交試驗(yàn)結(jié)果如表7所示。影響α-葡萄糖苷酶的抑制活性的因素依次為超聲時(shí)間>料液比>超聲溫度>超聲功率，對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制活性最佳的提取條件為A2B3C1D3，即超聲時(shí)間1.5 h，料液比1∶40(g·mL-1)，超聲溫度50 ℃，超聲功率350 W。在此最優(yōu)條件下進(jìn)行3次驗(yàn)證試驗(yàn)，所得的桑葚水提液對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率為81.4%。

由表8的方差分析可知，在各個(gè)因素中，超聲時(shí)間對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制率的影響極顯著，料液比、提取溫度對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響顯著，而超聲功率對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響不顯著。

表6正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

Table6Variance analysis of orthogonal experiments results

方差來(lái)源Source of varianceABCD誤差Error 總和Total 離差平方和Sum of squares of deviations541.94 41.60 3.91 1.15 1.15 588.61自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square270.97 20.80 1.96 0.58 0.58 F值F value469.72??36.06?3.39 1.00

**表示極顯著(P<0.01)；*表示顯著(P<0.05)。下同。

** indicated extremely significant difference (P<0.01)；* indicated significant difference (P<0.05). The same as below.

表7α-葡萄糖苷酶的提取工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果表

Table7Optimization of orthogonal test results for extraction process of alpha-glucosidase

試驗(yàn)號(hào)TestNo.ABCDα-葡萄糖苷酶酶抑制率Inhibition rate of alpha-glu-cosidase/%1111154.23 2122251.65 3133356.28 4212368.71 5223172.45 6231278.50 7313259.80 8321368.51 9332165.33 k154.05 60.91 67.08 64.00k273.22 64.20 61.90 63.32k364.55 66.70 62.84 64.50R19.17 5.79 5.18 1.18

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)以桑葚渣為原料，以α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，考查超聲溫度、超聲時(shí)間、料液比、超聲功率對(duì)水提液抑制酶活性的影響。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)優(yōu)化超聲輔助提取的工藝參數(shù)，得出對(duì)于α-淀粉酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度70 ℃、超聲時(shí)間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W。α-葡萄糖苷酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W。由于提取溫度對(duì)于α-淀粉酶抑制率的影響不顯著，對(duì)α-葡萄糖苷酶抑制率的影響比較顯著，因此提取溫度選擇50 ℃，以保證提取液對(duì)于兩種酶的抑制活性都較高。綜上，兩種酶抑制率最佳的工藝參數(shù)為提取溫度50 ℃、超聲時(shí)間1.5 h、料液比1∶40(g·mL-1)和超聲功率350 W，所得的桑葚渣提取液對(duì)α-淀粉酶、α-葡萄糖苷酶的抑制率分別為76.4%、81.4%。研究結(jié)果可為工業(yè)化提取桑葚渣中的降糖功能因子、實(shí)現(xiàn)桑葚渣的高值化利用提供技術(shù)依據(jù)。

表8正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

Table8Variance analysis of orthogonal experiments results

方差來(lái)源Source of varianceABCD誤差Error總和Total 離差平方和Sum of squares of deviations552.70 50.60 45.71 2.12 2.12 651.13 自由度 Freedom2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 8.00 均方Mean square276.35 25.30 22.86 1.06 1.06 F值F value260.90??23.88?21.58? 1.00