王偉科，袁衛(wèi)東，陸 娜，宋吉玲，閆 靜

(杭州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 蔬菜研究所，浙江 杭州 310024)

桑黃隸屬于真菌界(Fungi)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、層菌綱(Hymenomycetes)、非褶菌目(Aphyllophorales)、銹革孔菌科(Hymenochaetaceae)、桑黃屬(Sanghuangporus)，是一種珍貴的藥用真菌，因寄生于桑樹而得名，別稱桑臣、桑耳[1]?，F(xiàn)代科學(xué)研究證實(shí)，桑黃具有抗腫瘤、降血糖、護(hù)肝、抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗氧化等藥理作用，具有極高的開發(fā)利用價(jià)值[2]。桑黃屬種質(zhì)鑒定、新品種選育及高效栽培技術(shù)一直是科研人員研究關(guān)注的重點(diǎn)[3]。在前期研究中，利用ITS (internal transcribed spacer)序列分析技術(shù)，對(duì)從杭州、麗水及安徽金寨等地采集的22個(gè)桑黃樣品進(jìn)行了鑒定，成功區(qū)分出了楊樹桑黃(Fuscoporiagilva)及丁香桑黃(Inonotusbaumii)，并得到了17份桑樹桑黃(Sanghuangporussanghuang)樣品(樣品采集于不同地區(qū)的野外桑樹樹干)。鑒于ITS在種內(nèi)間隔區(qū)上表現(xiàn)的差異較小，不適宜種內(nèi)菌株的進(jìn)一步區(qū)分，需利用分子標(biāo)記技術(shù)進(jìn)一步研究上述試驗(yàn)中鑒定得到的桑樹桑黃種內(nèi)遺傳多樣性。

目前，ISSR(inter simple sequence repeat)、AFLP(amplified fragment length polymorphism)、RFLP(restriction fragment length polymorphism)，RAPD(random amplified polymorphic DNA)等分子標(biāo)記技術(shù)已廣泛運(yùn)用于藥用植物及食用大型真菌種類遺傳多樣性鑒定[4]。ISSR分子標(biāo)記技術(shù)以其高效、快速、穩(wěn)定、可靠等諸多優(yōu)點(diǎn)在物種遺傳多樣性鑒定、系統(tǒng)進(jìn)化等多個(gè)領(lǐng)域得到廣泛運(yùn)用。大量研究表明，ISSR分子標(biāo)記技術(shù)可以用于種群間或種群內(nèi)的遺傳多樣性分析[5]。在本研究中，我們擬采用ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)前期研究中獲得的17個(gè)桑樹桑黃樣品的遺傳多樣性進(jìn)行分析，以期明確桑樹桑黃種內(nèi)樣品之間的親緣關(guān)系。同時(shí)，為規(guī)范桑樹桑黃引種栽培、加強(qiáng)資源保護(hù)和品種選育打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

測(cè)試菌種(株)來自我國各主要桑黃真菌保藏單位，經(jīng)前期ITS序列鑒定為桑樹桑黃樣品(表1)。

1.2 菌絲體培養(yǎng)

從培養(yǎng)5～7 d 的PDA培養(yǎng)基平板上挑取2 mm ×2 mm的菌絲塊，接種于PDA液體培養(yǎng)基，25～27 ℃淺層靜置培養(yǎng)15～20 d。然后收集菌絲體，用無菌水漂洗2次，滅菌濾紙吸干水分，用于提取基因組DNA。

1.3 基因組DNA的提取

表1桑樹桑黃真菌測(cè)試菌株來源

Table1Strains used forSanghuangporussanghuanggenetic diversity study

序號(hào)No.菌株Strain菌株來源Source of strain序號(hào)No.菌株Strain菌株來源Source of strain1S1淳安微生物研究所Chun ′an Institute of Microbiology10S11延邊農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所Yanbian Agricultural Science Institute2S2淳安微生物研究所Chun ′an Institute of Microbiology11S15杭州市食用菌協(xié)會(huì)Hangzhou Edible Fungi Association3S4四川省農(nóng)科院Sichuan Academy of Agricultural Sciences12S17杭州市食用菌協(xié)會(huì)Hangzhou Edible Fungi Association4S5浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang13S21浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang5S6浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang14S22浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang6S7浙江臨安野生采集Wild collection from Linan, Zhejiang 15S23浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan, Zhejiang7S8浙江淳安野生采集Wild collection from Chunan Zhejiang16S26浙江衢州野生采集Wild collection from Quzhou, Zhejiang8S9桐廬桐君堂藥業(yè)有限公司Tonglu Tong Jun Tang Pharmaceutical Co. Ltd.17SKHCH浙江開化野生采集Wild collection from Kaihua, Zhejiang9S10浙江桐廬野生采集Wild collection from Tonglu, Zhejiang

取0.1 g菌絲體，液氮研磨后加入2% CTAB，用于基因組DNA的提取[6]。用0.8%瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop 2000 C超微量分光光度計(jì)(Thermo)檢測(cè)所提DNA濃度和純度。DNA樣品稀釋至40 ng·μL-1，用于ISSR擴(kuò)增。

1.4 ISSR引物設(shè)計(jì)與合成

ISSR引物參考哥倫比亞大學(xué)公布的序列及Wolfe等[7]的文獻(xiàn)，從中篩選出16條合適引物，引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列見表2。

1.5 ISSR分子標(biāo)記鑒定

ISSR擴(kuò)增體系根據(jù)各自引物退火溫度及Mg2+濃度進(jìn)行優(yōu)化，優(yōu)化后體系含10×PCR buffer 2 μL、25 mmol·L-1MgCl21.2 μL、10 mmol·L-1dNTPs 0.5 μL、10 μmol·L-1ISSR引物各1 μL、80 ng基因組模板DNA及1 U pfu DNA聚合酶，反應(yīng)總體積20 μL。

PCR擴(kuò)增程序?yàn)椋?94 ℃ 3 min；94 ℃ 20 s，46～52 ℃ 90 s，、72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。其中，每個(gè)引物的退火溫度優(yōu)先參考值為Tm值下調(diào)2 ℃。

1.6 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)

取目標(biāo)產(chǎn)物10 μL，加入6×上樣緩沖液1.5 μL，混勻后于1%瓊脂糖凝膠上電泳分離。電泳緩沖液采用TAE，穩(wěn)壓電泳，電壓120 V，40 min后停止電泳并拍照記錄。

1.7 數(shù)據(jù)采集分析

從凝膠成像系統(tǒng)得到的電泳譜帶中，選取清晰可辨的電泳條帶，以“1”和“0”記錄條帶的有或者無，在相同片段位置上存在擴(kuò)增帶時(shí)，記錄為“1”，不存在時(shí)記錄為“0”，將圖形數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換成數(shù)字?jǐn)?shù)據(jù)。并運(yùn)用NTSYS-pc2.0軟件，根據(jù)SM相似系數(shù)法(coefficient)計(jì)算樣品間的遺傳相似性，用UPGMA法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR多態(tài)性

用來擴(kuò)增桑樹桑黃的16條ISSR引物中，有10條獲得的ISSR帶型較好，各引物擴(kuò)增獲得的條帶片段大小范圍較大，為200～3 000 bp(表3)。這10條引物共擴(kuò)增獲得904條DNA條帶，其中，多態(tài)性條帶717條。引物P816、P817、P825、P828擴(kuò)增的多態(tài)性比率最高，為100%；引物P810擴(kuò)增的多態(tài)性比率最低，為55.7%(表3)。

2.2 DNA指紋圖譜

在桑樹桑黃ISSR擴(kuò)增DNA指紋圖譜中(圖1)，引物P825、P889分辨力最高，對(duì)桑樹桑黃基因組DNA擴(kuò)增效果最好，引物P5、P812擴(kuò)增條帶多態(tài)性最高，表明用該ISSR引物建立的指紋圖譜用來分析桑樹桑黃遺傳多樣性較好。

2.3 聚類分析

聚類分析結(jié)果表明，在遺傳相似系數(shù)約0.65處，17個(gè)菌株可劃分為2大類群：S4、S23、S26為一大類群；其余14個(gè)菌株為一大類群，在這一大類群中，在遺傳相似系數(shù)為0.73處，S11、S17、SKHCH各單獨(dú)聚為一類，S8，S21聚為一類，S5、S6、S7、S10、S22聚為一類，S1、S2、S9、S15聚為一類(圖2)。

2.4 遺傳相似性

17個(gè)桑樹桑黃的遺傳相似系數(shù)(表4)結(jié)果表表明，17個(gè)菌株的遺傳相似系數(shù)為0.57～0.99，平均遺傳相似系數(shù)為0.71。其中，S2與S26之間的遺傳相似系數(shù)最低，為0.58，可見S2與S26之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。S1與S2之間的遺傳相似系數(shù)最高，為0.99，說明S1與S2之間的親緣關(guān)系最近。

表2ISSR引物參考序列

Table2Sequences of tested ISSR primers

引物編號(hào)Primer No.序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)Tm值Tm value引物編號(hào)Primer No.序列(5′→3′)Sequence (5′→3′)Tm值Tm valueP812GAGAGAGAGAGAGAGAA49.8P974CACGAGAGAGAGAGAGA55.2P5GGATGCAACACACACACAC52.2P821TCTCTCTCTCTCTCTCCG54.9P826ACACACACACACACACC52.2P817AGAGAGAGAGAGAGAGG52.2P825ACACACACACACACACT49.8P829CACACACACACACACA49.2P823TCTCTCTCTCTCTCTCC52.2P824TGTGTGTGTGTGTGTG49.2P841GAGAGAGAGAGAGAGAYC52.6P816CACACACACACACACAT49.8P55KKRBRBRACACACACACAC46.5P828TGTGTGTGTGTGTGTGA49.8P889DBDACACACACACACAC47.4P810GAGAGAGAGAGAGAGAT49.8

表310條ISSR引物擴(kuò)增結(jié)果

Table3Amplification results of 10 different ISSR primers

引物編號(hào)Primer No.擴(kuò)增條帶數(shù)Number of amplified bands多態(tài)性條帶數(shù)Number of polymorphic bands多態(tài)性百分比/%Percentage of polymorphic bands片段大小Fragment length/bpP551148070.2400～2200P8101156455.7400～2200P81214310976.2200～2200P8166666100400～1600P8176060100600～2200P8256767100400～2200P8286262100400～2200P8291067267.9400～1400P889715476.1400～3000P51008383.0200～2200

M，DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，從上到下依次為：4、2.2、2、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4、0.2 kb； S1、S2、S4、S5、S6、S7、S8、S9、S10、S11、S15、S17、S21、S22、S23、S26、SKHCH為17個(gè)桑樹桑黃菌株。下同。M， DNA marker， The molecular weight of marker from top to bottom were 4， 2.2， 2， 1.8， 1.6， 1.4， 1.2， 1， 0.8， 0.6， 0.4， 0.2 kb， respectively; S1， S2， S4， S5， S6， S7， S8， S9， S10， S11， S15， S17， S21， S22， S23， S26 and SKHCH represent 17 wild Sanghuangporus sanghuang strains， respectively. The same as bellow.圖1 17個(gè)桑樹桑黃樣品的ISSR引物擴(kuò)增圖譜Fig.1 Amplification profiles of 17 Sanghuangporus sanghuang strains by ISSR primers

3 結(jié)論與討論

用表型特征和生理生化特征等傳統(tǒng)方法來鑒定野生桑樹桑黃子實(shí)體需對(duì)菌株開展出菇試驗(yàn)，但桑黃生長(zhǎng)緩慢，很難在短期內(nèi)獲得子實(shí)體，且其子實(shí)體表型易受外部環(huán)境影響，這些因素使得桑黃鑒定難度增加。近年來，迅速發(fā)展的DNA分子標(biāo)記技術(shù)因其具有鑒定快速、不受外界環(huán)境干擾、直接反映樣品遺傳本質(zhì)等優(yōu)點(diǎn)，被越來越多地用在食藥用菌種間、種內(nèi)的遺傳多樣性分析中。

圖2 17個(gè)桑樹桑黃樣本的UPGMA聚類圖Fig.2 UPGMA dendrogram of 17 strains of Sanghuangporus sanghuang

表417個(gè)桑樹桑黃菌株的遺傳相似系數(shù)

Table4Genetic similarity coefficient of 17 strains ofSanghuangporussanghuang

菌株S1S2S4S5S6S7S8S9S10S11S15S17S21S22S23S26StrainsS20.992S40.6140.622S50.6300.6380.654S60.6300.6380.6380.748S70.7320.7400.6770.8030.740S80.6300.6380.5750.7010.7640.709S90.8190.8270.6220.6850.7170.7560.717S100.6850.6930.6140.7870.8030.7800.7870.803S110.6930.7010.6220.7170.7010.7400.7480.7480.772S150.8030.7950.6220.6380.6540.7400.6690.9060.7560.701S170.6850.6930.6610.6930.7240.7170.6610.7090.7170.7240.677S210.6140.6220.6220.6690.6220.7090.7800.6380.6930.6690.6220.646S220.6540.6460.6770.7400.7400.6850.7240.7240.7950.6930.7090.748S230.6220.6140.6610.6140.6460.7010.6610.6770.6690.6460.6770.6540.5980.732S260.5830.5750.6540.6850.6850.6770.6540.6380.6610.6380.6380.6770.6380.7240.756SKHCH0.6380.6460.6140.6610.7090.6850.6610.6930.7010.6140.6930.7010.6610.7010.6380.661

本研究利用ISSR-PCR技術(shù)對(duì)經(jīng)ITS分子標(biāo)記鑒定后獲得的17個(gè)桑樹桑黃種內(nèi)菌株的遺傳多樣性進(jìn)行分析，有10條引物擴(kuò)增產(chǎn)物多態(tài)性豐富，條帶清晰，獲得DNA條帶904條，其中多態(tài)性條帶717條。這表明桑樹桑黃種內(nèi)菌株的遺傳多樣性比較豐富。用UPGMA進(jìn)行聚類分析表明，在遺傳相似系數(shù)約0.65處，17份樣品可劃分為2大類群，S4、S23、S26為一大類群，其余為一大類群。這表明ISSR分子標(biāo)記能有效地揭示桑樹桑黃種質(zhì)資源間豐富的多態(tài)性和遺傳多樣性。

基于ISSR分子標(biāo)記技術(shù)對(duì)桑樹桑黃種內(nèi)菌株的遺傳多樣性及親緣關(guān)系進(jìn)行分析，不僅能對(duì)桑黃開展系統(tǒng)進(jìn)化生物學(xué)研究，也能為我國桑黃資源開發(fā)利用、品種選育、栽培技術(shù)研究提供理論依據(jù)[8]。同時(shí)，對(duì)桑黃菌株進(jìn)行分類鑒定不能只依靠單一分子標(biāo)記技術(shù)，需進(jìn)一步結(jié)合菌絲形態(tài)、子實(shí)體特征、生理生化特性等開展系統(tǒng)的研究和分析，從而明確桑黃菌株之間的分類定位[9-10]。