于新友，李天芝

（山東綠都生物科技有限公司，濱州 256600）

兔輪狀病毒?。↙apine rotavirus disease）是由呼腸孤病毒科輪狀病毒屬兔輪狀病毒（Lapine rotavirus）引起的一種兔的腹瀉性病毒?。?］。各日齡兔均可感染，1～2月齡幼兔受到的危害較嚴(yán)重，成年兔可長期隱性帶毒［2］。該病一年四季均可發(fā)生，冬、春季節(jié)多發(fā)［3］。該病發(fā)病急，發(fā)病率高，傳播迅速［4］。病兔和帶毒兔是傳染源。病毒隨病兔糞便排出體外，污染飼料、飲水及環(huán)境通過消化道感染其他健康兔。病毒對外界環(huán)境抵抗力強(qiáng)［5］，兔場一旦感染后很難清除。2017年12月山東濱州某肉兔養(yǎng)殖場，飼養(yǎng)的200多只1月齡幼兔發(fā)生水樣腹瀉，陸續(xù)死亡20多只，抗生素治療無效，送本公司獸醫(yī)診斷中心就診，據(jù)臨床癥狀、剖檢病理變化以及實(shí)驗(yàn)室檢測，診斷為兔輪狀病毒病，并提出了一系列的防治措施，使疫情得到控制，現(xiàn)將病例診治情況報(bào)告如下。

1 臨床癥狀

病兔精神沉郁、食欲減退;被毛粗亂;發(fā)生水樣腹瀉糞便,呈淺綠色或灰白色，且含血液或黏液，有惡臭味，肛門周圍和后肢被糞便污染;病兔迅速消瘦、脫水，腹瀉2～3 d后死亡。

2 病理變化

對6只死亡兔和2只瀕死兔剖檢，可見胃內(nèi)充滿未消化乳汁，小腸出血、膨脹，內(nèi)充滿灰黃或灰黑色液狀，結(jié)腸淤血，盲腸擴(kuò)張，腸黏膜脫落，腸壁變薄，半透明狀，腸系膜淋巴結(jié)腫大，其他器官未見明顯變化。

3 診斷

3.1 細(xì)菌檢查

無菌采取病死兔肝臟、脾臟涂片，革蘭氏染色、鏡檢，未發(fā)現(xiàn)細(xì)菌，將病料劃線接種于血瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下培養(yǎng)24 h，均未見細(xì)菌生長。

3.2 球蟲檢查

取10 g新鮮兔糞便放于燒杯中，加入100 mL飽和食鹽水中，攪拌混勻，單層紗布過濾，將濾液倒入100 mL量筒中，靜置30 min，用接種環(huán)蘸取表面液體，涂于載玻片上，加蓋玻片，鏡檢，未發(fā)現(xiàn)球蟲卵囊。

3.3 病毒檢查

取病死兔新鮮糞便，稱重，按1∶10加入滅菌生理鹽水，反復(fù)凍融3次后，12 000 r/min離心10 min，取上清液，用孔徑0.22 μm的濾器過濾后，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

3.4 RT-PCR檢測

參照兔輪狀病毒VP7基因序列（U62153），采用Primer Premier 5.0引物設(shè)計(jì)軟件，設(shè)計(jì)1對引物，上游引物：5′-AATTTCCGCCTGGTTAGC-3′，下游引物：5′-ATCAAATCTGCGAGTTCC-3′，擴(kuò)增片段大小為 507bp。按AxyPrep體液病毒DNA/RNA小量試劑盒使用說明書提取3.3處理的病料樣品的RNA，進(jìn)行一步法RT-PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增反應(yīng)程序：50℃30 min，95℃3 min，然后進(jìn)入95℃ 30 s、55 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s，共 35 個(gè)循環(huán)，最后 72 ℃延伸8 min。取5 μL PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。結(jié)果顯示，在513 bp處有光亮條帶，與理論值大小相符（見圖1），PCR產(chǎn)物純化回收后與pMD18-T連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，挑取陽性菌送樣測序，結(jié)果見圖2，經(jīng)比對后顯示與參照的兔輪狀病毒VP7基因同源性為100%。因此，可基本確定兔死于兔輪狀病毒感染。

注：M.DL2000 MarKer，1.病料檢測擴(kuò)增結(jié)果，2.陰性對照。

圖2 擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果

3.5 動物回歸實(shí)驗(yàn)

6只1月齡幼兔，分成2組，實(shí)驗(yàn)組4只，對照組2只。實(shí)驗(yàn)組兔灌服3.3處理的病料，每只2 mL，對照組兔灌服生理鹽水，每只2 mL，隔離飼養(yǎng)觀察。結(jié)果4只實(shí)驗(yàn)兔均陸續(xù)出現(xiàn)水樣腹瀉，3 d內(nèi)全部死亡，剖檢可見小腸出血，腸壁變薄，腸黏膜脫落，內(nèi)充滿稀糞。取糞便樣品一步法進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增,檢測兔輪狀病毒核酸，結(jié)果為陽性，對照組家兔均健活。

4 治療措施

兔舍發(fā)病后，病死兔焚燒或深埋處理，對被污染的環(huán)境及用具等徹底消毒。兔舍保持清潔、溫暖、干燥，挑出病兔，隔離飼養(yǎng)，并口服補(bǔ)液鹽、電解質(zhì)，糾正脫水，防止酸中毒;同時(shí)采用收斂止瀉劑，緩解癥狀。飲水中添加抗生素，控制細(xì)菌繼發(fā)感染。

5 討論與小結(jié)

幼兔腹瀉病是導(dǎo)致幼兔死亡的一類重要疾病，給養(yǎng)兔業(yè)造成了一定的經(jīng)濟(jì)損失。引起幼兔腹瀉的病原主要有大腸桿菌、魏氏梭菌、沙門氏菌、泰澤氏菌、球蟲、輪狀病毒等［6］。對于細(xì)菌和球蟲可用抗生素進(jìn)行預(yù)防和治療，而對兔輪狀病毒引起的腹瀉目前尚無有效的治療方法，也無疫苗預(yù)防。因此，平時(shí)要加強(qiáng)飼養(yǎng)管理，飼喂優(yōu)質(zhì)全價(jià)飼料，飲用干凈水。盡量減少引種，引種時(shí)要隔離觀察半個(gè)月，確認(rèn)健康后，再并入大群飼養(yǎng)。兔舍要保持適宜的溫度、濕度，加強(qiáng)通風(fēng),定期清理糞便，每周至少消毒1次。

兔輪狀病毒可用恒河猴胚腎細(xì)胞（MA-104）和非洲綠猴腎細(xì)胞（CV1）分離培養(yǎng)［7］，一般初次分離培養(yǎng)較困難、周期長。本研究受條件所限并沒有對病毒分離培養(yǎng)，結(jié)合病兔臨床癥狀、病原PCR檢測及基因測序結(jié)果初步顯示幼兔死于輪狀病毒感染。采用病料處理液直接攻毒兔，成功復(fù)制出幼兔腹瀉的病例，充分表明該病毒對幼兔具有一定的致病力，下一步打算做病毒的分離，并進(jìn)一步研究病毒的特性。