王勇 王雪芬 卜勁松 章旺 徐丁

作者單位：312300 浙江省紹興市上虞人民醫(yī)院

陰溝腸桿菌是醫(yī)院感染常見的條件致病菌之一，因抗菌藥物的長期不合理應(yīng)用，常對多種抗菌藥物耐藥，造成臨床治療困難。其耐藥機(jī)制主要包括產(chǎn)生超廣譜β-內(nèi)酰胺酶（ESBLs）、產(chǎn)AmpCβ-內(nèi)酰胺酶（AmpC）、喹諾酮類（qnr）基因介導(dǎo)耐藥、整合子、主動外排泵系統(tǒng)作用、藥物作用靶位的改變、外膜通透性改變等［1］。本實(shí)驗(yàn)通過對陰溝腸桿菌產(chǎn)酶及耐藥基因檢測進(jìn)行研究，旨在為指導(dǎo)臨床合理選用抗生素及控制耐藥菌株在醫(yī)院內(nèi)的傳播提供理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 收集本院臨床分離去除同一病例同一部位的陰溝腸桿菌共89株。菌株采用法國生物梅里埃公司的VITEK-2 Compact進(jìn)行鑒定。質(zhì)控菌株大腸埃希菌ATCC25922、肺炎克雷伯菌ATCC700603購自中國食品藥品檢定研究院。

1.2 儀器與試劑 藥敏紙片：亞胺培南（IPM，10μg/片）、頭孢他啶（CAZ，30μg/片）、頭孢吡肟（FEP，30μg/片）、頭孢噻肟（CTX，30μg/片）、頭孢西丁（FOX，30μg/片）、頭孢噻肟/克拉維酸（CTX/CA，30/10μg/片）和頭孢他啶/克拉維酸（CAZ/CA，30/10μg/片）均購自英國OXOID公司。細(xì)菌質(zhì)粒DNA提取試劑盒購自北京天根。引物參考李美［2］的文獻(xiàn)由上海Invitrogen公司合成，PCR擴(kuò)增儀和凝膠成像分析系統(tǒng)為美國BIO-RAD公司產(chǎn)品。

1.3 方法 （1）陰溝腸桿菌產(chǎn)不同表型ESBLs酶和AmpC的檢測：依據(jù)明德松［3］建立的多底物協(xié)同-拮抗法（MSSAT），一步檢測出產(chǎn)ESBLs、不同型AmpC酶及二者不同組合產(chǎn)酶情況。（2）陰溝腸桿菌耐藥基因檢測：按照質(zhì)粒提取試劑盒的操作步驟提取陰溝腸桿菌質(zhì)粒DNA，采用PCR法擴(kuò)增ESBLs基因（TEM-1、SHV-12、SFO-1、VEB-3、CTX-M）、AmpC酶基因（ACT-1、DHA-1）和qnr基因（qnrA、qnrB、qnrS）。煮沸法制備PCR模板，反應(yīng)體系為：總體積均為50μl：ddH2O 25μl、Premix ExTaq 20μl、10μmmoL/L上、下游引物各1.5μl、模板DNA 2μl。熱循環(huán)參數(shù)：94℃預(yù)變性5 min，94℃變性50s，SHV-12 53℃退火 50s；CTX-M 55℃退火 50s；VEB-3、qnrB 56℃退火 50s；TEM-1、SFO-1、DHA-1、qnrA、qnrS 57℃退火50s；ACT-1 59℃退火50s；30個循環(huán)后，72℃最后延伸10min。PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳后觀察結(jié)果，抽取各陽性標(biāo)本PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送上海Invitrogen 公司進(jìn)行測序，應(yīng)用GenBank在線數(shù)據(jù)庫對比工具BLAST進(jìn)行序列比對分析。

2 結(jié)果

2.1 陰溝腸桿菌對14種抗生素的耐藥率 89株陰溝腸桿菌對14種常見抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)結(jié)果，見表1。

表1 陰溝腸桿菌對14種抗生素的耐藥率（%）

2.2 陰溝腸桿菌ESBLs和AmpC酶表型檢測結(jié)果 89株陰溝腸桿菌中，單產(chǎn)ESBLs13株（14.61%，13/89），單產(chǎn)AmpC酶41株（46.07%，41/89），同時產(chǎn)ESBLs和 AmpC酶 24株（26.97%，24/89）， 不 產(chǎn) 酶 11株（12.36%，11/89）。

2.3 陰溝腸桿菌質(zhì)粒介導(dǎo)耐藥基因檢測結(jié)果 （1）β-內(nèi)酰胺酶基因檢測結(jié)果：89株陰溝腸桿菌共測出43株攜帶β-內(nèi)酰胺酶基因，其中含一種β-內(nèi)酰胺酶基因的有18株，其余25株均含兩種或兩種以上β-內(nèi)酰胺酶基因。43株β-內(nèi)酰胺酶基因檢出菌中，ESBLs基因檢出率為38.20%（34/89），AmpC酶基因檢出率為19.10%（17/89），見表2。（2）qnr基因檢測結(jié)果：89株陰溝腸桿菌檢出qnr基因陽性有11株（12.36%，11/89），其中5株（5.62%，5/89）qnrA基因陽性；4株（4.49%，4/89）qnrB基因陽性；2株（2.25%，2/89）qnrS基因陽性。（3）β-內(nèi)酰胺酶表型與基因型檢測結(jié)果：通過MSSAT法檢測出的37株ESBLs表型陽性菌中有30株攜帶ESBLs耐藥基因；65株AmpC酶表型陽性菌中有15株攜帶AmpC酶耐藥基因。

表2 89株陰溝腸桿菌中β-內(nèi)酰胺酶基因的分布情況

3 討論

研究顯示，鈍化酶或滅活酶的產(chǎn)生、質(zhì)粒和整合子等可移動基因元件參與的耐藥、qnr基因介導(dǎo)的耐藥、外膜通透性下降、主動外排泵增強(qiáng)、生物被膜的形成等是引起陰溝腸桿菌耐藥的主要機(jī)制，其中以細(xì)菌產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶所占的比重較大［4］。近年來，因?yàn)閺V譜抗生素的廣泛使用，陰溝腸桿菌對抗菌藥物的耐藥性不斷增強(qiáng)，其多重耐藥（MDR）甚至泛耐藥（PDR）不斷被發(fā)現(xiàn)。本資料藥敏試驗(yàn)結(jié)果顯示，陰溝腸桿菌對青霉素類（氨卡西林）、一代頭孢（頭孢唑啉）耐藥率最高，對碳青霉烯類（亞胺培南、厄他培南）、氨基糖苷類（阿米卡星）、喹諾酮類（左氧氟沙星、環(huán)丙沙星）、四代頭孢（頭孢吡肟）藥物耐藥率較低，整體耐藥情況尚好，未發(fā)現(xiàn)較嚴(yán)重的抗菌藥物耐藥現(xiàn)象，說明本院對臨床抗生素的合理使用、規(guī)范管理工作較好，杜絕了由于完全經(jīng)驗(yàn)用藥、濫用藥物而造成的細(xì)菌耐藥率提高。

有研究發(fā)現(xiàn)，ESBLs和AmpC 酶是陰溝腸桿菌對β-內(nèi)酰胺類藥物產(chǎn)生耐藥的主要機(jī)制［5］。ESBLs主要由質(zhì)粒介導(dǎo)，能水解廣譜青霉素、單環(huán)類抗生素、β-內(nèi)酰胺酶及第三代頭孢類，但對碳青霉烯類、頭霉素及酶抑制劑敏感。AmpC 酶主要由染色體介導(dǎo)，屬Ambler分類中C類酶，Bush分類中I類酶，其水解底物比ESBLs更廣泛，可水解多種三代頭孢菌素類抗菌藥，且不受酶抑制劑所抑制，極易造成續(xù)發(fā)耐藥［6］。作者采用MSSAT法一步同時檢測ESBLs、AmpC酶的不同表型，其結(jié)果顯示，89株陰溝腸桿菌中，單產(chǎn)AmpC酶占46.07%，同時產(chǎn)ESBLs和AmpC酶占26.97%，低于楊洪芬［7］的52.87%，31.03%，高于吳財(cái)銘［8］的40.2%，17.1%、蘇國娟［9］的19.74%，14.47%。PCR結(jié)果顯示，ESBLs基因檢出率為38.20%，以TEM-1型為主，低于李美［2］的57.47%，高于王鳳霞［10］的15.79%，且均以TEM-1型為主；AmpC酶基因檢出率為19.10%，均低于上述報(bào)道。以上結(jié)果，一方面說明陰溝腸桿菌產(chǎn)ESBLs酶和AmpC酶的情況在不同地區(qū)、不同醫(yī)院間存在顯著差異，而產(chǎn)生這些差異的原因多樣化，比如和細(xì)菌存活環(huán)境、醫(yī)院用藥習(xí)慣、患者感染情況、醫(yī)院感染、消毒措施等有關(guān)；另一方面可能與相互之間檢測的基因類型不同有一定的關(guān)系。同時，通過對β-內(nèi)酰胺酶的表型、基因型檢測結(jié)果的比較發(fā)現(xiàn)，在37株ESBLs陽性菌中有30株攜帶ESBLs基因，未檢測出的7株菌株所攜帶ESBLs基因可能是本試驗(yàn)未檢測的；同時有4株菌檢測出ESBLs基因型呈陽性而表型卻呈陰性，這可能是因?yàn)榧?xì)菌酶產(chǎn)量低致使MSSAT法無法檢測出或者作者采用的MSSAT法是一步檢測ESBLs和AmpC酶，藥物紙片之間可能存在一定的干擾而影響到檢出，需要后續(xù)研究進(jìn)一步探討。在65株AmpC酶陽性菌中僅有15株檢測到質(zhì)粒型AmpC酶基因，大部分AmpC酶基因未檢測到的原因一方面可能與作者檢測的是質(zhì)粒型的AmpC酶基因，而AmpC酶只有少部分由質(zhì)粒介導(dǎo)有關(guān)，另一方面也可能因?yàn)楸驹囼?yàn)未檢測的AmpC酶基因型的存在；另外有2株菌AmpC酶基因型呈陽性而表型呈陰性，也可能與待檢菌產(chǎn)酶量低有關(guān)。

近年發(fā)現(xiàn)，質(zhì)粒上攜帶的qnr基因可介導(dǎo)喹諾酮類藥物的耐藥。qnr基因的作用機(jī)制為表達(dá)細(xì)菌DNA解旋酶保護(hù)蛋白，從而拮抗喹諾酮類藥物的作用，而喹諾酮類藥物正是通過作用于解旋酶而達(dá)到殺菌的作用［11］。質(zhì)粒介導(dǎo)的qnr基因具有水平傳播性，可以跨種傳播，導(dǎo)致耐藥擴(kuò)散。本實(shí)驗(yàn)共檢測出質(zhì)粒介導(dǎo)qnr基因陽性菌株11株，qnrA、qnrB、qnrS基因檢出率分別為5.62%、4.49%、2.25%，均低于李美［2］、張偉紅［12］等的報(bào)道，這可能和每個地區(qū)臨床抗菌藥物使用習(xí)慣等有關(guān)。在實(shí)驗(yàn)中作者發(fā)現(xiàn)攜帶qnr基因的菌株均呈MDR現(xiàn)象，其對14種抗菌藥物的耐藥率高達(dá)75%以上。考慮這是因?yàn)樵趒nr基因存在時，發(fā)生不同喹諾酮類耐藥機(jī)制的累加效應(yīng)，被認(rèn)為對抗菌藥物低水平耐藥能使細(xì)菌在次級突變出現(xiàn)的基礎(chǔ)上達(dá)到高水平耐藥［13］。同時，在11株qnr基因陽性菌株中，在產(chǎn)ESBLs和（或）AmpC酶菌株中檢出的有9株，說明qnr基因主要存在于產(chǎn)ESBLs和（或）AmpC 酶的菌株中，且其和細(xì)菌的多MDR有較大的關(guān)聯(lián)。

綜上所述，陰溝腸桿菌耐藥機(jī)制復(fù)雜，抗耐藥形勢嚴(yán)峻。在臨床抗感染治療中，應(yīng)考慮產(chǎn)ESBLs和AmpC酶陰溝腸桿菌有可能存在的MDR問題，同時對qnr基因介導(dǎo)的喹諾酮類藥物耐藥也應(yīng)引起足夠的重視。醫(yī)院應(yīng)規(guī)范抗菌藥物的使用和管理，嚴(yán)格按照藥敏試驗(yàn)結(jié)果合理使用抗菌藥物，同時加強(qiáng)臨床耐藥菌株監(jiān)測，避免經(jīng)驗(yàn)用藥、濫用藥物導(dǎo)致耐藥菌株產(chǎn)生。