俞建順 蔡丹莉 嚴(yán)茂祥 王小奇 桑怡 劉慶生*

作者單位：310021 杭州市丁橋醫(yī)院（俞建順）

310000 浙江省中醫(yī)院（蔡丹莉 嚴(yán)茂祥）

310007 杭州市中醫(yī)院（王小奇 桑怡 劉慶生）

胃癌是最常見(jiàn)的消化道腫瘤之一，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。其發(fā)病率在全球高居男性腫瘤第4位，病死率排在第3位［1-2］。慢性萎縮性胃炎伴有腸上皮化生（Intestinalmetaplasia，IM）和異型增生（Dyspldsia，Dys）的病理狀態(tài)稱為胃癌前病，是從正常胃黏膜發(fā)展至胃癌的重要階段。通過(guò)阻斷胃癌前病變的進(jìn)展可顯著降低胃癌的發(fā)病率。因此，探索胃癌前病變的發(fā)生機(jī)制，具有重要的臨床意義。研究發(fā)現(xiàn)，在胃癌前病變向胃癌的發(fā)展過(guò)程中，血管形成的程度逐漸加重，血管生成在胃癌發(fā)生的早期即已啟動(dòng)［3］。本文研究與血管生成密切相關(guān)的結(jié)締組織生長(zhǎng)因子（Connective tissue growth factor，CTGF）和內(nèi)皮素 -1（Endothelin-1，ET-1）在胃癌前病變組織中表達(dá)的變化，探索其發(fā)病機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康成年SPF級(jí)SD大鼠36只，4～5周齡，雌雄比例2∶1，來(lái)自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。適應(yīng)性喂養(yǎng)4周后至大鼠2+月齡，以2∶1配種，雌性大鼠懷孕后與雄性分開(kāi)喂養(yǎng)，自由飲水和撮食，選擇出生3d乳鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 主要試劑 1-甲基-3-硝基-1-亞硝基胍（MNNG，Lot：ZZRRL-OR）購(gòu)自東京化成工業(yè)株式會(huì)社，總RNA提取試劑盒（Lot：AK401）和RT試劑盒（Lot：AK3501）購(gòu)自大連TaKaRa公司，CHamQTM SYBRR qPCR Master Mix（Lot：AK7803）購(gòu)自南京諾唯贊生物科技有限公司，CTGF（B-6）鼠單克隆抗體（Lot：C0916）和 ET-1/2/3（H-38）鼠多克隆抗體（Lot：J1811）購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，GAPDH鼠單克隆抗體（Lot：6153702）、Goat anti-mouse IgG（H+L）（Lot：5223340）購(gòu)自杭州聯(lián)科生物技術(shù)有限公司。總蛋白提取試劑盒（Lot：20160318）購(gòu)自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司。引物由生工生物工程（上海）有限公司設(shè)計(jì)合成，CTGF上游引物5'-GAG TCG TCT CTG CAT GGT CA-3'，下游引物5'-GCA GCC AGA AAG CTC AAA CT-3'，擴(kuò)增片段121bp，ET-1 上游引物5'-CTG GAC ATC ATC TGG GTC AA-3'，下游引物5'-CTG TTC CCT TGG TCT GTG GT-3'，擴(kuò)增片段122bp；β-actin上游引物5'-TGT TGC CCT AGA CTT CGA GCA-3'，下游引物5'-CCA TAC CCA GGA AGG AAG GCT-3'，擴(kuò)增片段155bp。

1.3 動(dòng)物分組及處理 3d齡乳鼠共72只隨機(jī)分為正常組和模型組，每組各36只，雌雄各半。乳鼠與母鼠同養(yǎng)，母乳喂養(yǎng)，模型組乳鼠每天禁食2h后以0.1ml MNNG（800mg/L）灌胃，正常組灌服等量生理鹽水，連續(xù)10d。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均3周齡斷乳并分籠后采用全價(jià)顆粒飼料喂養(yǎng)，自由采食飲水。從MNNG灌胃結(jié)束后次日起計(jì)時(shí)，于實(shí)驗(yàn)第4周、16周、28周末禁食過(guò)夜后麻醉下每組分別處死大鼠12只，雌雄各半，取胃組織，沿大彎側(cè)剖開(kāi)，生理鹽水沖洗，取胃竇至胃體小彎側(cè)長(zhǎng)條組織固定在10%中性福爾馬林溶液中固定，剩余組織存入-75℃待用。

1.4 檢測(cè)方法 大鼠胃黏膜組織病理學(xué)變化使用常規(guī)HE染色檢測(cè)，診斷參考中國(guó)慢性胃炎共識(shí)（2012年，上海）和異型增生病變Pavoda國(guó)際分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)。qRTPCR法檢測(cè)雄性大鼠胃黏膜組織CTGF、ET-1 mRNA的表達(dá)：將大鼠胃黏膜內(nèi)提取的總RNA通過(guò)反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，隨后進(jìn)行PCR反應(yīng)，結(jié)果以β-actin為內(nèi)參，2-△△Ct表示各基因的相對(duì)表達(dá)量。Western blot檢測(cè)雄性大鼠胃黏膜組織CTGF、ET1/2/3蛋白表達(dá)：胃黏膜蛋白通過(guò)電泳、轉(zhuǎn)膜、一抗孵育（CTGF：1∶100；ET-1/2/3∶1∶200）、二抗孵育等步驟后化學(xué)發(fā)光檢測(cè)，目標(biāo)蛋白/GAPDH灰度值的比值即為各個(gè)蛋白的相對(duì)表達(dá)量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件包。計(jì)量資料以（±s）表示，采用單因素方差分析；計(jì)數(shù)資料采用非參數(shù)秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌前病變形成過(guò)程中胃黏膜病理變化 HE染色光鏡觀察發(fā)現(xiàn)，不同時(shí)相點(diǎn)的正常組大鼠胃黏膜上皮細(xì)胞較完整，腺體排列規(guī)則而整齊，細(xì)胞核位于基底部呈橢圓形，可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞及漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，有部分大鼠腺體數(shù)量輕度減少。造模組大鼠胃黏膜可見(jiàn)淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞的浸潤(rùn)，隨造模時(shí)間增加而程度加重，但未見(jiàn)明顯中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，模型組16周雄性大鼠、28周組胃黏膜慢性炎癥程度較同期正常組明顯增高（P＜0.05、P＜0.01）；造模組4周和16周時(shí)分別有1例和2例雄性大鼠胃黏膜固有腺體輕度萎縮，28周時(shí)所有大鼠出現(xiàn)不同程度萎縮，較同期正常組增高（P＜0.05）。模型組4周時(shí)大鼠腺體結(jié)構(gòu)排列尚規(guī)則，16周時(shí)雄性大鼠2例出現(xiàn)非確定不典型增生，28周時(shí)腺體結(jié)構(gòu)排列紊亂加重，大鼠出現(xiàn)不同程度不典型增生，以雄性較雌性明顯，各大鼠均未見(jiàn)腸上皮化生，模型組28周胃黏膜典型增生程度較同期正常組明顯增加（P＜0.05、P＜0.01）。見(jiàn)圖 1。

圖1 大鼠胃黏膜病理學(xué)變化（HE染色×100；A：正常組，B：模型4周組，C：模型16周組，D：模型28周組）

2.2 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1 mRNA表達(dá)的變化 在4周、16周和28周三個(gè)時(shí)相點(diǎn)，模型組雄性大鼠胃黏膜內(nèi)CTGF及ET-1 mRNA的表達(dá)均較正常組有升高趨勢(shì)。見(jiàn)圖2。

圖2 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET1mRNA表達(dá)的變化（x±s）

圖3 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表達(dá)的變化（s）；與正常組比較，?P＜0.05，#P＜0.01

圖4 雄性大鼠胃黏膜CTGF、ET-1/2/3蛋白表達(dá)條帶圖

2.3 雄性大鼠胃黏膜CTGF及ET-1/2/3蛋白表達(dá)的變化 模型組雄性大鼠4周時(shí)胃黏膜CTGF蛋白表達(dá)較正常組顯著降低，而在16周及28周較正常組升高，其中28周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。在胃黏膜內(nèi)ET-1/2/3蛋白的表達(dá)上，模型組雄性大鼠在4周和28周均較正常組大鼠升高，其中28周差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），而在16周則較正常組有降低趨勢(shì)。見(jiàn)圖3、4。

3 討論

血管生成是正常組織生長(zhǎng)和分化過(guò)程中的基本過(guò)程，并且在多種人類疾病中扮演著關(guān)鍵的角色。過(guò)度的血管生成見(jiàn)于牛皮癬、關(guān)節(jié)炎、糖尿病視網(wǎng)膜病變和惡性腫瘤等疾病中。腫瘤相關(guān)的血管生成目前被認(rèn)為是一種重要的治療靶點(diǎn)。然而，關(guān)于血管生成和癌前病變之間聯(lián)系的研究較少。關(guān)于血管生成和癌前病變之間存在聯(lián)系最初的證據(jù)來(lái)源于對(duì)微血管密度（MVD）的研究。MVD被發(fā)現(xiàn)在鱗狀細(xì)胞癌前病變中大范圍增加，如口腔黏膜、皮膚、子宮頸、外陰和肛管中［4］。Tuccillo等［5］發(fā)現(xiàn)，幽門(mén)螺桿菌相關(guān)胃炎內(nèi)存在血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）表達(dá)的增加，這一增加和胃黏膜內(nèi)血管的形成的增加相關(guān)。而VEGF表達(dá)的增加同樣存在于腸上皮化生和異型增生的胃黏膜腺體中，提示胃癌前病變同樣存在血管生成的增加。

CTGF首先是作為血小板來(lái)源的生長(zhǎng)因子相關(guān)絲裂原（人血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌）被發(fā)現(xiàn)的，一般由內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞平滑肌細(xì)胞和成肌纖維細(xì)胞表達(dá)，一些上皮細(xì)胞也可表達(dá)［6］。CTGF和多種調(diào)節(jié)過(guò)程有關(guān)，如血管再生、軟骨形成、骨發(fā)生、纖維化形成、糖尿病腎病和腫瘤形成等［7］。在不同的腫瘤組織中，其表達(dá)和腫瘤組織的生長(zhǎng)和抑制均有關(guān)。在乳腺癌、胰腺癌、胃癌等腫瘤組織中，CTGF的表達(dá)和腫瘤的進(jìn)展呈正相關(guān)，而在卵巢癌、結(jié)腸癌、軟骨肉瘤、肺癌等腫瘤組織中則呈負(fù)相關(guān)。在胃癌患者體內(nèi)，其表達(dá)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腹膜轉(zhuǎn)移的程度呈正相關(guān)，而和生存時(shí)間呈負(fù)相關(guān)。CTGF參與癌細(xì)胞的浸潤(rùn)與轉(zhuǎn)移、遷移、血管生成和失巢凋亡等過(guò)程。在低氧環(huán)境下，CTGF被激活并釋放，通過(guò)調(diào)控VEGF誘導(dǎo)的血管生成，在腫瘤的形成與發(fā)展中起到了重要的作用。

ET是一種由21個(gè)氨基酸組成的內(nèi)源性肽，包括ET-1、ET-2和ET-3三種亞型，是迄今為止最有效的血管收縮劑，并且和細(xì)胞增殖、遷移，血管生成和細(xì)胞凋亡有密切關(guān)系。ET-1是研究最為廣泛的內(nèi)皮素，是人類心血管系統(tǒng)內(nèi)最豐富的類型。ET-1主要來(lái)源于血管內(nèi)皮細(xì)胞，但也可由其他細(xì)胞生成，如肺、腎臟和結(jié)腸等器官的上皮細(xì)胞，巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞，周圍腸神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的脈絡(luò)叢和某些神經(jīng)元以及反應(yīng)性神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞［8］。ET-1的表達(dá)在多種腫瘤中均有增加，包括肺、前列腺、結(jié)直腸、肝臟、乳腺和卵巢癌，這可能和其對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移和血管生成的促進(jìn)作用和細(xì)胞凋亡的抑制作用有關(guān)。研究證明，低氧能夠刺激內(nèi)皮細(xì)胞合成ET-1［8-9］，而ET-1參與的血管生成在腫瘤的發(fā)生與發(fā)展中起到了重要作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，胃癌前病變大鼠胃黏膜組織存在胃黏膜內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，血流減少導(dǎo)致局部的缺血、瘀血和水腫等，說(shuō)明胃組織受損及繼發(fā)炎癥時(shí)，均伴隨缺氧現(xiàn)象。隨著造模時(shí)間的延長(zhǎng)，大鼠逐漸出現(xiàn)胃癌前病變，胃黏膜內(nèi)CTGF及ET mRNA的表達(dá)呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，而盡管模型組大鼠在4周時(shí)CTGF蛋白的表達(dá)較正常組減少，在16周時(shí)ET-1/2/3蛋白的表達(dá)較正常組有減少趨勢(shì)，但在造模28周時(shí)兩者均較正常組顯著升高。說(shuō)明MNNG誘導(dǎo)的大鼠胃癌前病變的發(fā)生與發(fā)展伴隨著CTGF和ET-1的表達(dá)的增加。造模早期兩者的下降可能和機(jī)體的自我保護(hù)機(jī)制有關(guān)：通過(guò)減少兩者的表達(dá)抵抗血管的發(fā)生，從而防止胃癌前病變的發(fā)生。

綜上所述，低氧環(huán)境可誘導(dǎo)CTGF和ET-1的激活，從而促進(jìn)血管的生成，這可能是胃癌前病變的發(fā)生和發(fā)展的機(jī)制之一，可為防止胃癌前病變提供新的思路。