俞斐 章浙忠 陳琳 魯遙

作者單位：310000 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院

原發(fā)性肝癌（primary liver cancer，PLC）是臨床上最為常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，起病隱匿，病死率高，在腫瘤致死原因中位居第二位［1］。絕大數(shù)患者確診時(shí)已為中晚期，從而失去了外科手術(shù)治療的機(jī)會(huì)而采用化療，但不良反應(yīng)較多［2］。姜黃素（CUR）自從被報(bào)道具有抗癌活性以來(lái)，廣泛受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注?，F(xiàn)代藥理研究表明，CUR可抑制癌細(xì)胞的生長(zhǎng)，在腫瘤的治療方面，CUR的作用顯著。但由于其水溶性和穩(wěn)定性差，在腸道易發(fā)生葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的Ⅱ型代謝，口服后在體內(nèi)代謝快，血藥濃度較低，生物利用度差，嚴(yán)重地限制了其臨床應(yīng)用［3］。四氫姜黃素（THC）作為姜黃素的體內(nèi)代謝產(chǎn)物，本實(shí)驗(yàn)對(duì)THC進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)及其初步的機(jī)制探討，為更好的開(kāi)發(fā)和利用姜黃素類(lèi)化合物的藥用價(jià)值提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)和研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物及肝癌細(xì)胞株 健康雄性昆明KM小鼠90只，體質(zhì)量（20±2）g，浙江中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供；小鼠腹水型H22肝癌細(xì)胞株購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。

1.2 主要試劑與儀器 THC購(gòu)于國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；環(huán)磷酰胺（CTX）購(gòu)于上海國(guó)藥控股有限公司；冰醋酸、Tween-80購(gòu)于廣東光華化學(xué)廠有限公司；蛋白定量試劑盒購(gòu)于上海貝博生物科技有限公司。AR1140電子天平（美國(guó)奧豪斯公司）；SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（蘇凈集團(tuán)安泰公司）；DHG-9023A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.3 方法 （1）藥物劑量設(shè)計(jì)：本節(jié)實(shí)驗(yàn)研宄中（除了用以初步探討作用機(jī)制的H22腹水瘤小鼠模型），雄性KM小鼠被隨機(jī)分成6組，每組各10只。所有小鼠在實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)7d。正常組（Intact）和模型組（Vehicle）給予預(yù)防藥物的相應(yīng)溶劑（0.5%Tween-80），預(yù)防給藥組小鼠給予低、中、高劑量的THC（5、10、20mg/kg）、環(huán)磷酰胺（CTX，30mg/kg），按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續(xù)給藥7d。（2）小鼠造模：將H22腹水瘤細(xì)胞凍存管從液氮罐中取出，置于37℃的溫水中使其融化，然后用吸管吸取適量細(xì)胞懸液至離心管內(nèi)，加入10倍量無(wú)菌PBS緩沖液，混勻后于臺(tái)式離心機(jī)中離心5min（1000r/min），棄去上清液，收集H22細(xì)胞，重復(fù)清洗操作三次；之后用無(wú)菌PBS緩沖液調(diào)整為1×107/ml的細(xì)胞懸液，取100μl置于1ml EP管內(nèi)，向其中加入等體積的0.4%臺(tái)盼藍(lán)染液，混勻后通過(guò)顯微鏡觀察，利用臺(tái)盼藍(lán)拒染法進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，觀察H22細(xì)胞的存活率。經(jīng)觀察后計(jì)算，細(xì)胞存活率＞96%。隨后向每只小鼠腹腔注射H22細(xì)胞懸液0.2ml復(fù)制H22腹水瘤小鼠模型（相當(dāng)于瘤細(xì)胞數(shù)2×106/只），正常組除外。

1.4 H22腹水瘤模型小鼠生存周期實(shí)驗(yàn) 小鼠腹水瘤造模成功24 h后，將KM小鼠隨機(jī)分為6組：空白對(duì)照組，模型對(duì)照組，陽(yáng)性對(duì)照（CTX）組，THC低、中、高劑量組，每組各10只，除陽(yáng)性對(duì)照（CTX）組腹腔注射（0.1ml/10g）給藥外，其余各組灌胃給藥1次/d，連續(xù)7d，每日觀察各組小鼠生活、飲食情況以及毛色等外觀狀況，統(tǒng)計(jì)各組小鼠的生存周期，比較各組之間的差異。

1.5 細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀檢測(cè)細(xì)胞活力與Western Blot檢測(cè)蛋白表達(dá) 鼠腹水瘤造模成功24h后，將KM小鼠隨機(jī)分為3組：模型對(duì)照組、陽(yáng)性對(duì)照（CTX）組和THC（20mg/kg）組，每組各10只，除陽(yáng)性對(duì)照（CTX）組腹腔注射給藥外，其余各組灌胃給藥，按0.1ml/10g體重給藥1次/d，連續(xù)給藥7d。每次灌胃前，測(cè)量統(tǒng)計(jì)各小組的體重。末次給藥1h后，脫頸處死各組小鼠，用無(wú)菌注射器抽取每只小鼠的腹水，取200μl用PBS緩沖鹽溶液處理后，立即檢測(cè)其細(xì)胞活力（全自動(dòng)細(xì)胞計(jì)數(shù)分析儀），另外腹水收集后采用Western Blot檢測(cè)H22腹水瘤細(xì)胞中的Bax、Bcl-2的蛋白表達(dá)水平。取各組小鼠的胸腺和脾臟組織，精密稱(chēng)重后記錄各組小鼠的免疫臟器重量。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，各組間的差異比較采用方差分析（One-way ANOVA），實(shí)驗(yàn)結(jié)果以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響 THC對(duì)H22腹水瘤小鼠生存周期的影響如圖1所示，在接種H22腹水瘤細(xì)胞4～5 d后，各組小鼠飲食和活動(dòng)均開(kāi)始減少，腹部開(kāi)始出現(xiàn)膨脹，喜歡群居和蜷臥，體重也明顯增加。與模型組相比，THC（5、10、20mg/kg）給藥組能延長(zhǎng)小鼠的生存周期，平均生存時(shí)間隨著給藥劑量的升高而提高，且與模型組差異顯著（THC低劑量組：P＜0.05，其余各組：P＜0.001），結(jié)果提示，THC能顯著延長(zhǎng)小鼠的生存周期。因此，在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中，選取THC的高劑量組（20 mg/kg）對(duì)H22腹水瘤小鼠模型進(jìn)行初步的機(jī)制探討。

圖1 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠生存周期的影響（n=10，?P＜0.05，#P＜0.001）

2.2 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠體重及腹水瘤細(xì)胞活力的影響 如圖2、3所示，給小鼠接種H22腹水瘤細(xì)胞后，小鼠的體重顯著上升，與模型組小鼠相比，THC在第5天后能明顯抑制小鼠的體重（5～7d，P＜0.001）；與模型組相比，THC治療后H22腹水瘤細(xì)胞活力顯著下降（P＜0.001），提示THC對(duì)小鼠惡性腹水有抑制作用。

圖2 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠體重的影響

圖3 THC對(duì)H22腹水瘤細(xì)胞活力的影響（n=10，?P＜0.05，???P＜0.001）

2.3 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響 THC對(duì)腹水瘤小鼠免疫臟器的影響如圖4所示，由圖可知與空白組小鼠相比，接種H22腹水瘤細(xì)胞后小鼠的免疫器官無(wú)明顯影響，而在給予THC干預(yù)后，小鼠的脾臟指數(shù)和胸腺指數(shù)也均無(wú)明顯變化，表明給予THC后對(duì)小鼠的免疫器官無(wú)明顯影響；相反，給予陽(yáng)性藥CTX治療后，小鼠的脾臟指數(shù)（P＜0.001）和胸腺指數(shù)（P＜0.001）均顯著下降，表明陽(yáng)性藥CTX可能對(duì)小鼠的免疫器官有毒副作用。

2.4 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響 THC對(duì)腹水瘤小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響如圖5所示，在分析統(tǒng)計(jì)各組小鼠條帶的灰度值后發(fā)現(xiàn)，THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達(dá)（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)含量（均P＜0.01），提示THC可能參與了Bcl-2介導(dǎo)的線粒體凋亡通路并能改善Bcl-2體系的蛋白表達(dá)。

圖4 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠免疫器官的影響（n=10，?P＜0.001）

圖5 THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)水平的影響（n=3，?P＜0.01）

3 討論

在H22腹水瘤模型小鼠生存周期實(shí)驗(yàn)中，THC能顯著延長(zhǎng)小鼠的生存周期。而在后面對(duì)各組小鼠的體重、細(xì)胞活力和免疫器官指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析的時(shí)候發(fā)現(xiàn)，THC能有效抑制腹水瘤小鼠體重，抑制小鼠腹水細(xì)胞的活力，與陽(yáng)性藥CTX相比THC不影響小鼠體內(nèi)的免疫器官，提示THC基本無(wú)毒副作用。因此在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中，初步探究THC對(duì)H22腹水瘤模型小鼠的作用機(jī)制。

細(xì)胞的增殖和凋亡的動(dòng)態(tài)平衡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。許多蛋白在細(xì)胞凋亡的發(fā)生和發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用［4］。Bcl2家族蛋白是細(xì)胞內(nèi)一組結(jié)構(gòu)上同源功能上相關(guān)的蛋白。主要分為兩大類(lèi)：一類(lèi)是抑制細(xì)胞凋亡，如Bcl2、Bcl-xl等；另一類(lèi)是促進(jìn)細(xì)胞凋亡，如Bax、Bcl-xs等。其中Bcl2、Bax的表達(dá)為代表。Bcl2和Bax蛋白水平表達(dá)的高低，與細(xì)胞凋亡直接相關(guān)。Bax和Bcl-2通過(guò)形成同源或異源二聚體來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，當(dāng)Bax形成同源二聚體時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡；Bax與Bcl-2形成異源二聚體時(shí)則實(shí)現(xiàn)了Bcl-2抑制細(xì)胞凋亡的功能。這與本實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)THC給藥組與模型組小鼠相比能顯著提高Bax的蛋白表達(dá)（均P＜0.01）和抑制Bcl-2的蛋白表達(dá)含量（均P＜0.01）的結(jié)果類(lèi)似。更多的臨床研究表明，多種不同類(lèi)型的腫瘤均出現(xiàn)了Bax蛋白水平表達(dá)下降，Bcl2表達(dá)升高的現(xiàn)象，其兩者比例決定了細(xì)胞凋亡的走向。若Bcl-2/Bax比例增高，則抑制細(xì)胞凋亡，反之，則促進(jìn)細(xì)胞凋亡［5］。

在本實(shí)驗(yàn)H22腹水瘤模型小鼠的實(shí)驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)THC能提高腹水瘤小鼠的生活質(zhì)量和生存周期，降低小鼠的體重和腹水量。進(jìn)一步的機(jī)制研究表明THC能夠通過(guò)上調(diào)Bax蛋白水平，下調(diào)Bcl-2蛋白水平，提示THC可通過(guò)調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)蛋白而抑制H22腹水瘤的生長(zhǎng)，從而為四氫姜黃素的進(jìn)一步研究提供理論基礎(chǔ)。