李肖瑛 白壽軍* 查芳芳 朱迎春

作者單位：201700 復旦大學附屬中山醫(yī)院青浦分院

完整的足細胞，包括足突和其間的裂隙膜，是維持蛋白質(zhì)濾過屏障功能的重要結(jié)構(gòu)基礎［1］。足細胞數(shù)量減少，足突融合或裂隙膜蛋白表達減少都將導致大量蛋白尿［2-3］。足細胞數(shù)量減少也被認為是局灶節(jié)段腎小球硬化的最關鍵致病因素之一，而局灶節(jié)段腎小球硬化是各種腎小球疾病進展至腎小球硬化的共同途徑［4］。因此，足細胞細胞生物學的改變和腎小球疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關。作者前期工作發(fā)現(xiàn)激活環(huán)磷酸腺苷（cAMP）信號可以防止嘌呤霉素氨基核苷（PAN）誘導的線粒體膜電位下降［5］，提示cAMP的保護作用可能與線粒體途徑有關。線粒體生物學作用包括氧化磷酸化、生成動力學、分裂/融合動力學以及線粒體基因組轉(zhuǎn)錄等，這些作用和足細胞損傷的關系尚不完全清楚。因此本研究將探討線粒體形態(tài)變化在cAMP防止足細胞凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 細胞培養(yǎng) 條件永恒小鼠足細胞株由Peter Mundel教授贈送。足細胞培養(yǎng)簡要描述如下：誘導分化培養(yǎng)液為含10% FBS RPMI1640培養(yǎng)液；條件培養(yǎng)液在上述培養(yǎng)液中再加入10IU/ml小鼠γ-IFN，促進足細胞增殖。本研究采用15-25代足細胞。生長于I型膠元被覆培養(yǎng)皿中的細胞使用條件培養(yǎng)液，培養(yǎng)于33℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中（許可條件），隔天換液。誘導分化時，足細胞被轉(zhuǎn)移至37℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中使用分化培養(yǎng)液培養(yǎng)（非許可條件），隔天換液1次。細胞在非許可條件下生長6d后，大部分細胞呈分枝狀，細胞體變大，細胞核變大顏色變淺，部分細胞出現(xiàn)雙細胞核。待細胞分化后，使用各種試劑或藥物刺激。

1.2 線粒體形態(tài)染色 細胞接種于12孔板，待分化以及藥物刺激后，使用celllight mitchondria-GFP Bacman2.0試劑（美國，Life Technology公司）直接對細胞線粒體進行染色，簡要步驟為：試劑以10μl/104細胞的量加入到12孔板的每個孔中，過夜后直接在共聚焦顯微鏡下觀察。

1.3 透射電鏡觀察 每組標本收集≥107個細胞，浸泡在2.5%戊二醛中4℃固定過夜，再用1.0%鋨酸作后固定，然后用LR白色樹脂包埋（英國）。超薄切片（70nm）用乙酸雙氧鈾染色后在電鏡75kV（飛利浦CM120；荷蘭）電壓下觀察。

1.4 CCK-8檢測 按照CCK-8檢測說明書（上海碧云天）操作，敘述如下：細胞接種于96孔板，分化≥6d后使用各種藥物刺激，在刺激后的96孔板中，每孔加10μl CCK-8檢測試劑，37℃孵育1h后，于450nm波長讀取吸光度，所得吸光度值即為足細胞相對含量。

1.5 Western blot分析 檢測足細胞p-Drp1、Drp1、Fis1、OPA1、Mfn1、cleaved caspase3、caspase3蛋 白質(zhì)表達的表達。提取細胞總蛋白，10%SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)至PVDF膜，封閉后分別用兔抗人p-Drp1一抗（美國Cell Signaling Technology公司，1∶1000），兔抗人Drp1一抗（美國Cell Signaling Technology公司，1∶1000），兔抗人Fis1一抗（美國，Alexis生物化學公司，1∶500），兔抗大鼠OPA1一抗（英國Abcam公司，1∶1000），兔抗人Mfn1一抗（英國Abcam公司，1∶1000），兔抗人cleaved caspase 3一抗（美國Cell Signaling Technology），1∶1000），兔抗人caspase 3一抗（美國Cell Signaling Technology），1∶ 1000）4℃孵育過夜，山羊抗兔熒光二抗（美國LI-COR，1∶5000）室溫孵育1h，紅外成像系統(tǒng)（美國LI-COR Odyssey）顯影后用Image J軟件分析結(jié)果。

1.6 統(tǒng)計學方法 采用SPSS13.0統(tǒng)計軟件。計量資料以（s）表示，組間比較使用方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 cAMP信號防止PAN誘導的線粒體分裂 通過線粒體染色和透射電鏡直接觀察線粒體的形態(tài)變化，PAN 100μg/ml孵育足細胞72h，與對照組相比，線粒體較多的處于分裂狀態(tài)，而使用cAMP激動劑pCPT-cAMP（pCPT）預孵育24h后，線粒體未分裂，更多的處于融合狀態(tài)。提示cAMP信號可能通過調(diào)節(jié)足細胞內(nèi)線粒體的分裂/融合防止足細胞凋亡。

2.2 PAN通過抑制足細胞線粒體外膜Mfn1蛋白表達，抑制線粒體融合 Mfn1是線粒體外膜蛋白，主要調(diào)節(jié)線粒體外膜融合。如圖1所示，發(fā)現(xiàn)PAN時間依賴性抑制足細胞Mfn1的表達。Drp1、Fis1是調(diào)節(jié)線粒體分裂的蛋白，OPA1是線粒體內(nèi)膜蛋白，主要調(diào)節(jié)線粒體內(nèi)膜融合，如圖2，發(fā)現(xiàn)PAN并不影響Drp1、Fis1、OPA1的表達，提示PAN可能通過抑制Mfn1的表達，從而抑制線粒體融合。

圖2 PAN不影響足細胞中p-Drp1、OPA1、Fis1的表達

圖3 PKA信號促進足細胞中p-Drp1和Mfn1表達增多

圖4 PKA信號防止PAN誘導的Mfn1表達減少，并促進足細胞中p-Drp1表達

2.3 cAMP信號促進Drp1磷酸化和Mfn1蛋白表達，促進線粒體融合 pCPT 100μm刺激足細胞30min、60min可以直接促進足細胞生成p-Drp1，刺激24h、48h還可以直接誘導Mfn1表達上升，如圖3。PAN和pCPT共同作用于足細胞依然可以誘導p-Drp1生成，pCPT 100μm預處理24h還可以防止PAN誘導的Mfn1表達下降，如圖4。提示cAMP信號可能通過促進Drp1磷酸化和Mfn1蛋白表達增加，促進線粒體融合。

2.4 線粒體分裂/融合直接調(diào)節(jié)足細胞凋亡 為了證實足細胞凋亡和線粒體分裂/融合的關系，使用花生四烯酸（Ara）和Mdivi-1兩個試劑，它們能分別誘導線粒體分裂和融合。Ara時間依賴性誘導足細胞數(shù)量下降和cleaved caspase3表達上升，而且可以完全阻斷pCPT的保護作用。對照組、PAN組、Ara組、pCPT+PAN組、pCPT+PAN+Ara組 吸 光 度分 別 為（1.01±0.08）、（0.67±0.07）、（0.37±0.03）、（0.87±0.06）、（0.36±0.03），P＜0.05。Mdivi-1 可 以部分緩解PAN誘導的足細胞數(shù)量下降，對照組、PAN組、Mdivi-1（10μM）+PAN 組、Mdivi-1（50μM）+PAN組吸光度分別為（0.76±0.02）、（0.48±0.01）、（0.51±0.01）、（0.51±0.01），P＜0.05。Mdivi-1 也可以部分防止PAN誘導的cleaved caspase3表達上升。見圖 5、6。

圖5 Ara誘導足細胞凋亡（注：A、C：CCK-8檢測足細胞數(shù)量；B、D：western blot檢測足細胞cleaved caspase3表達變化。與對照組比較，?P＜0.05；與PAN組比較，#P＜0.05；與pCPT+PAN組比較，▲P＜0.05）

圖6 Mdivi-1部分緩解PAN誘導的足細胞凋亡（注：A：CCK-8檢測足細胞數(shù)量；B：western blot檢測足細胞cleaved caspase3表達變化。與對照組比較，?P＜0.05；與PAN組比較，#P＜0.05）

3 討論

線粒體是細胞有氧代謝的中心環(huán)節(jié)，是細胞內(nèi)反應性氧簇的重要來源，也是調(diào)節(jié)細胞功能、分化、生存/凋亡的一個重要的細胞器［6-8］。線粒體損傷時，線粒體完整性被破壞可導致多種促凋亡因子包括細胞色素C的釋放，最終引起細胞凋亡。細胞色素C從線粒體釋放至胞漿是一個關鍵性步驟，細胞色素C與胞質(zhì)中的細胞凋亡蛋白酶活化因子1結(jié)合，直接激活caspase 9，從而引發(fā)細胞凋亡［9］。

線粒體是高度動態(tài)的細胞器，并且處于分裂與融合的重復周期［10］。促進線粒體分裂和抑制線粒體融合可以導致細胞色素C釋放，凋亡以及線粒體膜電位下降。線粒體分裂和融合平衡紊亂可以誘導心肌細胞凋亡，這也是心衰過程中心肌細胞丟失的重要機制［10］。

作者發(fā)現(xiàn)，PAN刺激的足細胞與正常對照組相比，其線粒體較多的處于分裂狀態(tài)，而pCPT預處理的足細胞線粒體較多的處于融合狀態(tài)。通常線粒體分裂意味著細胞需要更多的ATP或者是清除受損的線粒體。雖然線粒體分裂由Drp1啟動，但是并未發(fā)現(xiàn)Drp1水平在PAN刺激的足細胞中有所上升。Mfn1是維持線粒體外膜融合的蛋白，PAN刺激后Mfn1表達下降，提示PAN通過抑制線粒體融合，從而促進了足細胞線粒體的分裂，那么足細胞內(nèi)的線粒體在PAN作用下增加分裂可能是一個被動的過程。線粒體融合過程可以促進正常線粒體將完整的組成成分提供給受損線粒體，包括DNA和蛋白質(zhì)，從而維持正常的線粒體功能，防止線粒體外膜破損以及凋亡因子釋放。過多的分裂的線粒體將削弱細胞對于損傷因子的防護和修復能力，因此增加了細胞的凋亡或死亡。

PKA可以磷酸化Drp1蛋白的絲氨酸637位點，磷酸化的Drp1從線粒體釋放入細胞質(zhì)，導致線粒體融合，同時抑制細胞凋亡。本研究中，pCPT誘導足細胞Drp1絲氨酸637位點磷酸化作用未受到PAN的影響。同時，pCPT還誘導了Mfn1表達上升。提示cAMP信號不僅可以通過增加Drp1磷酸化促進線粒體融合，而且可以通過恢復Mfn1的表達防止PAN誘導的線粒體分裂。因此，cAMP可能從主動和被動兩種方式，促進了足細胞線粒體的融合，增加足細胞對于損傷的防護和修復。作者還使用了線粒體分裂誘導劑Ara成功誘導了足細胞數(shù)量減少以及cleaved caspase3表達上升，使用Mdivi-1部分抑制了PAN誘導的足細胞損傷，也提示了線粒體分裂可能與足細胞凋亡有關。

本研究主要觀察線粒體分裂/融合與足細胞凋亡之間的關系。線粒體的其他功能變化也和足細胞損傷有關。例如，有研究發(fā)現(xiàn)激活促進線粒體生成的雌激素相關受體α可以防止PAN誘導的足細胞損傷［11］。Zhu等［12］發(fā)現(xiàn)線粒體功能障礙介導了鹽皮質(zhì)激素對足細胞的損傷。線粒體途徑產(chǎn)生的反應性氧簇是葡萄糖誘導足細胞損傷的最重要途徑之一。說明線粒體功能異常在足細胞損傷中具有重要作用。應進一步檢測PKA信號是否對于足細胞中線粒體的生成、線粒體DNA損害以及線粒體ROS產(chǎn)生存在有益的作用。

綜上所述，PAN通過誘導線粒體分裂導致足細胞凋亡，pCPT通過激活cAMP信號通路防止線粒體分裂，從而起到足細胞保護作用。