陸明　胡鵬飛　林冬銘　黃抒偉

[摘要] 目的 探討消瘀泄?jié)犸媽υ煊皠┠I病（CIN）大鼠是否具有保護作用及其相關機制。 方法 將24只雄性SD大鼠隨機分為4組：正常組（A組）、CIN組（B組）、消瘀泄?jié)犸嫷蛣┝拷M（C組）和消瘀泄?jié)犸嫺邉┝拷M（D組）。造模后48 h處死大鼠，測定各組大鼠血清肌酐、尿素氮水平，HE和PAS染色觀察各組腎臟組織病理變化，Western Blot檢測各組Bax、Bcl-2、Caspase-3、P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達量。 結果 造模48 h后，與A組相比，B組大鼠血清肌酐和尿素氮水平均明顯升高（P<0.05）;腎小管上皮細胞出現(xiàn)空泡樣變性、管腔變大及腎間質水腫，腎小球組織未發(fā)現(xiàn)明顯改變;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達上調（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達同時上調（P<0.05）。與B組相比，C、D組血清肌酐和尿素氮水平明顯下降（P<0.05）;腎小管上皮空泡樣變性減少;Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達下調（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達同時下調（P<0.05）。 結論 消瘀泄?jié)犸媽υ煊皠┠I病大鼠具有預防作用，其機制可能是通過抑制PI3K/Akt/mTOR信號通路過度激活從而抑制腎小管上皮細胞凋亡。

[關鍵詞] 消瘀泄?jié)犸?造影劑腎病;凋亡;PI3K/Akt/mTOR信號通路

[中圖分類號] R692? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2019）02-0037-04

造影劑腎?。–ontrast induced nephropathy，CIN）是指造影劑引起的腎功能急驟下降[1]。隨著造影劑在放射學診斷檢查和介入手術中的普遍應用，CIN已成為一種臨床常見的并發(fā)癥，CIN發(fā)生率在普通人群中為0.6%～2.3%，高危人群中可達90%[2]，是僅次于腎灌注不足和腎毒性藥物引起的醫(yī)院獲得性急性腎損傷的第三大常見原因[3]。實際工作中對CIN的認識仍然不夠，目前尚無有效措施逆轉CIN病程進展，最好的治療方法就是預防，而在預防CIN發(fā)生方面方法不多，目前臨床療效較為肯定的僅有水化。消瘀泄?jié)犸嬋∽匀珖现嗅t(yī)李學銘臨床驗方，該方在氣虛夾瘀濁的慢性腎病患者中已取得良好療效[4]，本研究希望通過中西醫(yī)結合手段進一步研究中藥方劑在CIN中的應用，明確消瘀泄?jié)犸媽IN大鼠腎功能的保護作用及探討其相關機制。

1 材料與方法

1.1 動物和試劑

選擇SPF級雄性SD大鼠24只，體重（220±10）g，由浙江中醫(yī)藥大學動物實驗研究中心提供，動物生產單位為上海西普爾必凱實驗動物有限公司，許可證號：SCXK（滬）2013-0016。消瘀泄?jié)犸嬋接牲S芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g 組成，以上中藥均由浙江中醫(yī)藥大學附屬第二醫(yī)院中藥房提供;吲哚美辛（1 mg/100 g）和 N-硝基-L-精氨酸甲酯（1 mg/100 g）均購自Sigma 公司;復方泛影葡胺注射液（20 mL/12 g）購自西安漢豐藥業(yè)有限責任公司（國藥準字H20034058）。廣譜磷酸酶抑制劑混合物（規(guī)格：1 mL）和熒光二抗（規(guī)格：100 μL）均購自博士德生物工程有限公司;cleaved-Caspase-3抗體、GAPDH抗體、Bcl-2抗體、Bax抗體、Akt抗體、P-Akt抗體、mTOR抗體、P-mTOR抗體均購自Cell Signaling Technology公司，規(guī)格均為100 μL。于2016年7月～2018年2月進行試驗。

1.2 動物造模和分組

隨機分為4組，6只/組：正常組（A組）、CIN組（B組）、消瘀泄?jié)犸嫷蛣┝拷M（C組）和消瘀泄?jié)犸嫺邉┝拷M（D組）。其中B、C、D組按照參考文獻制備CIN 模型[4]，具體方法如下：大鼠造模前禁水12 h，自由進食。稱重后按10%水合氯醛0.32 mL/100 g（購自陜西盤龍醫(yī)藥物流有限公司，規(guī)格：500 mL，國藥準字H37022673）腹腔注射麻醉。尾靜脈注射10 mg/kg吲哚美辛;15 min后注射10 mg/kg L-NAME;15 min后注射2 g/kg的泛影葡胺。A、B組：灌胃等劑量生理鹽水。C、D組于造模前1周開始每日灌胃消瘀泄?jié)犸嫾鍎?，灌胃量分別為成人標準體重（60 kg）常規(guī)用量20、50倍。各組均未予水化治療。

1.3 腎功能和組織形態(tài)學檢測

1.3.1 腎功能檢測? 造模后48 h 處死動物，尾靜脈采血，分離血清。由全自動生化分析儀測定血清肌酐和尿素氮水平。

1.3.2 HE和PAS染色? 取大鼠腎臟組織，經多聚甲醛固定、乙醇脫水、二甲苯透明、石蠟包埋，制作病理切片，切片厚度4 μm，HE染色和PAS染色后光學顯微鏡下觀察[5，6]。

1.4 Western Blot法檢測

取大鼠腎臟組織標本液氮研碎，加入裂解液，經勻漿離心后，取上清液用BCA法測定蛋白濃度，變性后-20℃保存。取各組樣本50 μg，進行12% SDS-PAGE并濕轉至PVDF膜上，用3% BSA室溫搖床封閉2 h，加入3%封閉液稀釋的抗體（1：1000稀釋），4℃冷庫搖床過夜，用TBST洗滌15 min×3次。然后，加入二抗（1：2000稀釋），室溫下?lián)u床孵育2 h后，用TBST洗滌15 min×3次。ECL發(fā)光液顯色，膠片掃描后用Imgae J軟件進行圖像分析，以GAPDH（1：1000稀釋）作為內參照對比，比值結果表示其蛋白的相對含量[7]。

1.5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)均采用 SPSS 22.0軟件統(tǒng)計分析，計量資料用（x±s）表示，組間比較采用單因素方差進行分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 消瘀瀉濁飲對CIN大鼠腎功能的影響

見表1。與A組相比，B組大鼠血清肌酐和尿素氮水平明顯升高（P<0.05）;與B組相比，C、D組血清肌酐和尿素氮水平顯著下降（P<0.05），且D組較C組肌酐降低更明顯（P<0.05），D組較C組尿素氮降低不明顯，無統(tǒng)計學差異（P=0.438>0.05）。

表1? ?各組大鼠腎功能指標比較（x±s，μmol/L）

注：與B組相比，#P<0.05 ;與C組相比，*P<0.05

2.2 HE染色

A組大鼠腎小管、腎小球、腎間質區(qū)未見明顯異常，B組大鼠可見腎小管上皮細胞空泡樣變性，管腔明顯擴大，刷狀緣部分脫落，間質水腫。C、D組大鼠與B組相比，均能有效減輕大鼠腎小管-間質病變，腎小管上皮細胞空泡樣變區(qū)域明顯減少，且D組較C組明顯。見封三圖2。

2.3 PAS染色

PAS染色顯示：A組腎小球血管袢薄而清晰，較少糖原沉積;與A組相比，B、C、D組腎小球基底膜、系膜均未見明顯糖原沉積和增生，各組間未見明顯差異。見封三圖3。

2.4 Western Blot法檢測

Western Blot檢測結果顯示：與A組相比，B組大鼠腎臟組織Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達上調（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達均同時上調（P<0.05）;與B組相比，C、D組Bax/Bcl-2和Caspase-3蛋白表達下調（P<0.05），且P-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達均同時下調（P<0.05）。見圖1和表2。

3討論

造影劑腎?。–ontrast-induced nephropathy，CIN）又稱造影劑誘導的急性腎損傷，被定義為造影劑暴露后48～72 h后血肌酐絕對值較基礎值升高≥0.5 mg/dL（44.2 μmol/L）或相對升高≥25%，并排除其他可能引起腎損傷的原因[8]。雖然大多數(shù)CIN患者血肌酐1～4周可恢復正常水平，但仍不能認為CIN發(fā)病是一良性的、一過性的肌酐增高。Maioli等[9]研究顯示：腎小球濾過率<60 mL/min的PCI患者中CIN的發(fā)病率為12.1%，其中18.6%的患者3個月后的肌酐清除率仍較基礎值減少25%，急性腎損傷可演變?yōu)槌掷m(xù)性腎損傷。對比劑對腎臟的毒性包括分子的直接化學毒性（離子性、含碘物質）、滲透毒性及組分中與黏度相關的毒性[10，11]。目前研究認為直接腎小管毒性和氧化應激是造影劑腎病的主要病理生理機制，而細胞凋亡在兩者中均發(fā)揮著重要的作用[12]。

消瘀泄?jié)犸嬘衫罾献浴夺t(yī)林改錯》“補陽還五湯”化裁而來。全方由黃芪30 g、川牛膝12 g、桃仁12 g、地龍12 g、制軍10 g、車前草20 g 組成。大黃為君藥，具有通利逐瘀、蕩滌胃腸、清除邪濁之功;桃仁、牛膝和地龍具有活血祛瘀之功，共為臣藥;生黃芪為佐藥，補氣行血，加大活血化瘀之功;車前草利水通淋，導濁下行，是為使藥[13]。因此消瘀泄?jié)犸嬀哂信判乖煊皠p少造影劑滯留對腎臟的毒性作用;同時其活血化瘀能改善腎臟血流，減少氧化應激對腎臟的損害。本研究通過復制CIN大鼠模型，結果顯示CIN大鼠組（B組）血清肌酐和尿素氮水平明顯升高，且出現(xiàn)腎小管上皮細胞空泡樣變性，刷狀緣部分脫落，間質水腫，說明造影劑腎病大鼠造模成功，與既往研究相符[14]。與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿M可減少腎小管上皮細胞空泡樣變性和腎間質水腫，降低大鼠血清肌酐和尿素氮水平，從而改善CIN大鼠腎功能。

細胞凋亡是一種程序性細胞死亡[15]，而Bcl-2家族和caspase家族在細胞凋亡轉導途徑中起著非常重要的調節(jié)作用，特別是在線粒體途徑中。Bcl-2和bax蛋白位于線粒體上游，是線粒體膜通透性改變的重要調節(jié)基因。它們的過表達可以控制上游cyt-c的釋放和下游caspase-3蛋白酶的活化并介導細胞凋亡[16]。本研究中，Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿MCaspase-3和Bax/Bcl-2蛋白表達下調;說明消瘀泄?jié)犸嬁赡芡ㄟ^Bcl-2/Bax介導的線粒體凋亡信號傳導途徑抑制腎小管上皮細胞凋亡。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mammalian aarget of rapamycin，mTOR）是一種進化上相對保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，可受生長因子、營養(yǎng)物質和能量等多因素影響，可通過磷酸化其下游的靶蛋白，參與基因的轉錄和蛋白的表達，進而影響凋亡等的生物活性[17]。細胞外的生長因子和細胞因子可通過受體酪氨酸激酶激活PI3K，活化的PI3K催化PIP2轉化為PIP3，并在PDK1的協(xié)同下磷酸化Akt使其激活?；罨腁kt磷酸化TSC2，而被磷酸化的TSC2將從負向調控Rheb活性增強，正向調控mTOR的活性[18]。本研究顯示：與模型組相比，消瘀泄?jié)犸嫿MP-Akt/Akt和P-mTOR/mTOR蛋白表達下調，提示消瘀泄?jié)犸嫿M可有效地抑制過度激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路。

本研究的局限性：本研究缺乏腎小管上皮細胞實驗，未能使用mTOR抑制劑雷帕霉素反證消瘀泄?jié)犸嬕种颇I小管上皮細胞凋亡是通過介導PI3K/Akt/mTOR信號通路，且消瘀泄?jié)犸嬀哂徐铕?、活血化瘀之功效，其對CIN大鼠的保護機制還可能與氧化應激、炎癥反應、自噬和細胞存活等通路相關[19-21]。

綜上所述，本研究證實：消瘀泄?jié)犸嬜鳛榕R床上治療慢性腎病患者的臨床驗方，其具有通利逐瘀等功效，可有效改善CIN大鼠腎功能，其機制可能是通過抑制過度激活的PI3K/Akt/mTOR信號通路從而抑制腎小管上皮細胞凋亡，但還需進一步的實驗證實。

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（收稿日期：2018-07-26）