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(揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇揚(yáng)州 225127)

蘋果和柑桔、葡萄、香蕉被稱為世界四大水果,其中蘋果以其豐富的營(yíng)養(yǎng)被列為四大水果之冠。我國(guó)蘋果品種的資源非常豐富,也是產(chǎn)量最高的水果,因其富含維生素、多酚、多糖和蛋白等多種成分,具有非常高的食用價(jià)值和營(yíng)養(yǎng)保健作用。果蔬組織中大量存在著酚類物質(zhì)、類黃酮類等植物次生代謝產(chǎn)物,它們與果蔬的成熟衰老、色澤發(fā)育、組織褐變、品質(zhì)和風(fēng)味的形成、抗逆和抗病特性等都有著非常密切的關(guān)系,其對(duì)果蔬產(chǎn)品的貯藏加工性能和果蔬的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值都具有重要影響。蘋果中所含的多酚類生物活性物質(zhì),具有很強(qiáng)的抗氧化功效,這類化合物的含量通常隨著對(duì)一些生物或非生物脅迫因素的應(yīng)答而有所變化[1]。但果蔬的品質(zhì),尤其是營(yíng)養(yǎng)品質(zhì),在采收后即進(jìn)入消耗損失階段,如何保持并提高采后果蔬的品質(zhì)成為近年來的研究熱點(diǎn)。有研究者通過對(duì)鱷梨的研究發(fā)現(xiàn)1-MCP可以延長(zhǎng)保質(zhì)期,顯著提高果實(shí)中可溶性總酚,類黃酮和總抗氧化能力的積累水平,并且當(dāng)1-MCP濃度升高時(shí)效果更加顯著[2]。短波紫外線(Ultraviolet-C,UV-C)照射處理采后果蔬,對(duì)其次生代謝物酚類等抗氧化物質(zhì)的產(chǎn)生也具有一定的促進(jìn)作用。有研究表明,用低劑量UV-C照射采后番茄[3]、草莓[4]和藍(lán)莓[5]后,其果實(shí)中類黃酮和多酚物質(zhì)的含量顯著增加,同時(shí)抗氧化能力顯著增加。目前利用1-MCP和UV-C照射處理采后蘋果后研究其次生代謝物及抗氧化活性的變化還未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以蘋果為試材,采用1-MCP和UV-C照射處理,研究蘋果在4 ℃下貯藏一定時(shí)間后蘋果中VC含量、次生代謝物(酚類物質(zhì)、類黃酮物質(zhì))含量、PAL活性、CAT活性、SOD活性、超氧陰離子產(chǎn)生速率、過氧化氫含量的變化。分別通過ABTS法和DPPH法來測(cè)定果肉的抗氧化能力,為開展蘋果采后貯藏保鮮研究提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅富士蘋果 采自徐州豐縣果園,采收大小一致、色澤均勻,表面無機(jī)械損傷和病蟲害的果品,采收之后立刻運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行處理;1-MCP 蘭州嘉誠生物科技有限公司;鉬酸銨、Folin-酚、沒食子酸、蘆丁、2,6-二氯靛酚、氮藍(lán)四唑(NBT)、核黃素、對(duì)氨基苯磺酸、α-萘胺、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH) 生工生物工程(上海)有限公司,試劑均為分析純;總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 南京建成生物工程研究所。

30W/G30T8型UV-C燈管 Philips公司;58 L塑料箱 禧天龍塑料制品公司;TN-2340手持式紫外線強(qiáng)度計(jì) 臺(tái)灣泰納;PT-MR-2100型高速組織勻漿機(jī) 瑞士Kinematica;高速冷凍離心機(jī)(5804R)德國(guó)Eppendorf公司、BS210S型電子分析天平 北京賽多利斯天平有限公司;Lambda 35型紫外可見分光度計(jì) 美國(guó)Perkinelmer公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理 1-MCP處理:在室溫下用2 μL/L濃度的1-MCP密閉處理12 h,處理完成后打開箱子通風(fēng)1 h。UV-C處理:在前期試驗(yàn)的基礎(chǔ)上,篩選出適宜的UV-C劑量用于試驗(yàn)。使用UV-C燈管,有效波長(zhǎng)為254 nm,用手持式紫外線強(qiáng)度計(jì)測(cè)得距離紫外燈約40 cm處的紫外光強(qiáng)度為0.2 mW/cm2,照射時(shí)間為20 min,照射劑量為2.5 kJ/m2,照射過程中將果實(shí)翻轉(zhuǎn),使其受照均勻。1-MCP處理聯(lián)合UV-C處理:果實(shí)經(jīng)2 μL/L濃度的1-MCP 處理后再以UV-C劑量2.5 kJ/m2照射20 min。

對(duì)照組不做任何處理,將對(duì)照組和處理后的蘋果放至4 ℃冰箱中進(jìn)行貯藏,分別在處理的當(dāng)天、7、14、21、28 d時(shí)取果肉部分切成小塊,用液氮處理后裝在聚乙烯薄膜塑料袋中,并保存在-75 ℃超低溫冰箱中用于分析實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 抗壞血酸含量的測(cè)定 采用 2,6-二氯靛酚法測(cè)定[6]。取5 g樣品,加入15 mL草酸和無水乙酸鈉在冰浴條件下勻漿,用1 g/L草酸和4 g/L無水乙酸納溶液定容至20 mL,10000 r/min 4 ℃15 min。取10 mL上清液置于25 mL的三角瓶中,用已標(biāo)定的2,6-二氯靛酚溶液滴定至微紅色,且15 s不褪色為止,記下用量，同時(shí)以10 mL 1 g/L草酸溶液作為空白進(jìn)行滴定。重復(fù)三次。結(jié)果表示為mg/100 gFW。

1.2.3 總酚和類黃酮含量的測(cè)定 總酚和類黃酮含量參照Rodov等[7]的方法進(jìn)行。稱取5 g樣品,加入20 mL 40%的乙醇勻漿,10000 r/min 4 ℃離心15 min,上清液即為提取液。總酚含量以每g新鮮果實(shí)中相當(dāng)于沒食子酸的毫克數(shù)表示,表示為mg/g 鮮重。類黃酮含量以每g新鮮果實(shí)中相當(dāng)于蘆丁的毫克數(shù)表示,表示為mg/g鮮重。

1.2.5 苯丙氨酸解氨酶(PAL)活性的測(cè)定 參照Surjadinata等[9]的方法。以每小時(shí)1 g新鮮組織催化L-苯丙氨酸生成1 μmol的肉桂酸為1個(gè)酶活力單位(U),酶活以U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.2.6 超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定 參照Mittler等[10]的方法。反應(yīng)液中含13 mmol/L甲硫氨酸,63 μmol/L NBT,1.5 μmol/L核黃素,50 mmol/L pH7.8磷酸緩沖液,加入適量酶液后,20 ℃光照反應(yīng)30 min。560 nm處測(cè)定OD值。以抑制光化還原50%的酶用量為一個(gè)酶活力單位(U)。SOD的酶活以U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.2.7 過氧化氫酶(CAT)活性的測(cè)定 參照Mittler等[10]的方法。反應(yīng)液含0.2 mL酶液,加入1.5 mL 50 mmol/L pH7.0磷酸緩沖液和0.3 mL 10 mmol/L H2O2,加入后立即計(jì)時(shí),并在240 nm測(cè)吸光度。以1 min內(nèi)OD240減少0.01的酶量為一個(gè)酶活力單位(U)。CAT的酶活以U/mg蛋白質(zhì)表示。

1.2.8 DPPH自由基清除率 參照Odriozola-Serrano等[11]的方法。隨機(jī)稱取5 g果肉,加入25 mL甲醇溶液,冰浴條件下勻漿,之后4 ℃、10000 r/min冷凍離心25 min,取上清液備用。準(zhǔn)確移取0.2 mL上清液于試管中,加入2.8 mL 0.05 mg/mL DPPH,充分混勻,37 ℃水浴靜置30 min后測(cè)定517 nm下吸光度Ai(以無水乙醇為參比);同時(shí)測(cè)定DPPH溶液與無水乙醇混合后的吸光度A0,以及上清液與無水乙醇混合后的吸光度Aj。

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/A0]×100

1.2.9 抗氧化活力 采用ABTS抗氧化能力檢測(cè)試劑盒測(cè)定。樣品的抗氧化能力用μg Trolox equivalents(TE)/g FW表示,試驗(yàn)重復(fù)三次。

1.3 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)數(shù)據(jù)重復(fù)3次,采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)的方差分析、顯著性檢驗(yàn)和相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中抗壞血酸含量的影響

從圖1可以看出,在整個(gè)貯藏期間,對(duì)照和處理蘋果果實(shí)抗壞血酸含量呈先上升后下降的趨勢(shì),貯藏第21 d,抗壞血酸含量達(dá)到峰值。1-MCP、UVC以及聯(lián)合處理組貯藏過程中抗壞血酸含量均顯著高于對(duì)照組(p<0.05),1-MCP和UVC處理組差異不顯著,1-MCP聯(lián)合UV-C處理組顯著高于單一處理組(p<0.05)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,采用2 μL/L l-MCP結(jié)合2.5 kJ/m2UV-C處理可顯著延緩果實(shí)抗壞血酸含量的降低。

圖1 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中抗壞血酸含量的影響Fig.1 Effect of different treatment on ascorbic acid contents during post-harvest storage of apple fruit

2.2 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中總酚和類黃酮含量的影響

對(duì)照和不同處理組蘋果果實(shí)的總酚和類黃酮含量變化如圖2所示。從圖2中可以看出,在整個(gè)貯藏期間,總酚含量總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),對(duì)照和單一處理組類黃酮含量在21 d時(shí)有所下降,復(fù)合處理組類黃酮含量貯藏前期(0～7 d)快速上升,7 d后趨于平緩。單一處理和復(fù)合處理果實(shí)的總酚和類黃酮含量顯著高于對(duì)照組(p<0.05),在貯藏過程中均顯著促進(jìn)了果實(shí)中類黃酮和多酚物質(zhì)的合成(p<0.05),1-MCP和UVC單一處理組差異不顯著,復(fù)合處理效果最好,這表明1-MCP和UV-C處理能顯著促進(jìn)蘋果果實(shí)中次生代謝物總酚和類黃酮物質(zhì)的產(chǎn)生,可提高果實(shí)的品質(zhì),且1-MCP和UV-C聯(lián)合處理有顯著的增效作用。Vicente等[12]對(duì)辣椒的研究也表明,一定劑量的UV-C照射處理可較好的維持辣椒的品質(zhì),且顯著降低了產(chǎn)品的腐敗率。對(duì)柑橘的研究也表明,采用UV-C照射處理2 h后,柑橘果實(shí)中類黃酮的含量增加了55%,顯著提高了其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[13]。本實(shí)驗(yàn)用1-MCP聯(lián)合UV-C處理能夠提高蘋果果實(shí)類黃酮和總酚含量的增加,結(jié)果表明一定濃度的1-MCP和一定劑量的UV-C照射處理對(duì)蘋果果實(shí)貯藏過程中次生代謝產(chǎn)物的誘導(dǎo)和積累具有顯著作用(p<0.05)。

圖2 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中總酚和類黃酮含量變化的影響Fig.2 Effect of different treatment on total phenol and flavonoid contents during post-harvest storage of apple fruit

2.3 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中產(chǎn)生速率和H2O2含量的變化

圖3 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中產(chǎn)生速率和H2O2含量變化的影響Fig.3 Effect of different treatment on total phenol and flavonoid contents during post-harvest storage of apple fruit

2.4 不同處理對(duì)蘋果采后果實(shí)苯丙氨酸解氨酶活性的影響

PAL作為催化苯丙烷類代謝反應(yīng)上游的關(guān)鍵酶,同時(shí)也是酚類物質(zhì)代謝過程中的重要限速酶。從圖4中可以看出,在整個(gè)貯藏期間,蘋果果肉的PAL活性整體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì),在第21 d達(dá)到頂峰。單獨(dú)處理以及聯(lián)合處理都能刺激蘋果果肉PAL活性的升高,對(duì)照蘋果果肉PAL活性最低,聯(lián)合處理組PAL活性在整個(gè)貯藏過程中活性最高,說明聯(lián)合處理能夠顯著提高PAL活性(p<0.05)。本實(shí)驗(yàn)可知1-MCP聯(lián)合UV-C處理蘋果在采后可顯著提高PAL的活性,與酚類物質(zhì)含量的增加密切相關(guān)(r=0.921)。這與Formica-Oliveira等[14]報(bào)道的UV-C促進(jìn)了鮮切胡蘿卜PAL活性的結(jié)果一致。

圖4 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中PAL活性變化的影響Fig.4 Effect of different treatment on PAL activity during post-harvest storage of apple fruit

2.5 不同處理對(duì)蘋果采后果實(shí)在貯藏過程中SOD和CAT活性的變化

圖5 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中SOD和CAT活性變化的影響Fig.5 Effect of different treatment on activities of SOD and CAT during post-harvest storage of apple fruit

2.6 不同處理對(duì)蘋果采后果實(shí)抗氧化能力的影響

本實(shí)驗(yàn)采用ABTS法和DPPH法來測(cè)定蘋果果實(shí)的抗氧化能力,如圖6所示,在果實(shí)貯藏過程中,其抗氧化能力總體呈現(xiàn)先上升然后下降的趨勢(shì),且兩種方法均顯示在貯藏第21 d達(dá)到抗氧化能力的峰值。ABTS法測(cè)定時(shí)處理組的抗氧化能力均顯著高于對(duì)照組,且復(fù)合處理組顯著高于單一處理組(p<0.05);DPPH法測(cè)定時(shí),復(fù)合處理組從14 d開始顯著高于其他組(p<0.05),貯藏后期,各處理組的抗氧化能力顯著增加。本實(shí)驗(yàn)采用了不同的方法測(cè)定了對(duì)照及處理后的蘋果貯藏過程中抗氧化能力的變化,并研究了其與多酚和類黃酮含量之間的相關(guān)性。結(jié)果表明,采用DPPH法測(cè)得的果蔬抗氧化能力與酚類物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.681和0.575;ABTS法測(cè)得的果蔬抗氧化能力與酚類物質(zhì)和類黃酮物質(zhì)的相關(guān)系數(shù)分別為0.879和0.715,均達(dá)到極顯著相關(guān)(p<0.01)。

圖6 不同處理對(duì)蘋果果實(shí)采后貯藏過程中抗氧化能力的影響Fig.6 Effect of different treatment on antioxidant capacity during post-harvest storage of apple fruit

本研究結(jié)果與UV-C處理促進(jìn)了草莓[15]等果品中抗氧化活力結(jié)果一致。Jagadeesh等[16]對(duì)番茄的抗氧化能力研究表明,采用ABTS法測(cè)定得出其抗氧化能力與類黃酮和多酚物質(zhì)的含量之間具有相關(guān)性。對(duì)含花色苷的10種果蔬進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn),采用DPPH法測(cè)定得出的不同果蔬的抗氧化能力與果蔬中所含有的多酚類物質(zhì)的含量之間具有一定的相關(guān)性[17]。余小林等[18]也研究了38種不同類別的果蔬產(chǎn)品的抗氧化能力,結(jié)果發(fā)現(xiàn)果蔬中總酚含量的多少與抗氧化能力直接相關(guān),且相關(guān)系數(shù)到了0.81。本研究結(jié)果表明蘋果果實(shí)中的抗氧化能力與其多酚和類黃酮含量密切相關(guān),且與多酚的相關(guān)性更高。不同抗氧化能力測(cè)定方法結(jié)果一致,但相關(guān)系數(shù)存在差異,本實(shí)驗(yàn)中ABTS法測(cè)定的總抗氧化性和多酚及類黃酮的相關(guān)系數(shù)更高。

3 結(jié)論