,

(1.寧夏回族自治區(qū)食品檢測中心,寧夏銀川 750002; 2.寧夏回族自治區(qū)疾病預(yù)防控制中心理化科,寧夏銀川 750004)

喹諾酮類抗生素(Quinolones)是人工合成的廣譜性抗菌藥物,具有高效、低毒等特點(diǎn),現(xiàn)已廣泛用于畜牧業(yè)。由于缺乏科學(xué)的理論指導(dǎo),喹諾酮類抗生素濫用現(xiàn)象十分嚴(yán)重,使得生物體產(chǎn)生耐藥性,并且對環(huán)境產(chǎn)生污染,從而對人體健康構(gòu)成威脅[1-2]。四環(huán)素類抗生素(Tetracyclines)是一類堿性廣譜抗生素,包括從鏈霉菌屬培養(yǎng)物提取的四環(huán)素、土霉素、金霉素,以及半合成的強(qiáng)力霉素等,可對肝臟和腸胃造成損害,還能導(dǎo)致嬰兒先天性耳聾,損害男性生殖系統(tǒng),造成不孕不育等[1-3]。農(nóng)業(yè)部235公告對雞蛋中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的殘留情況做出明確規(guī)定[4],惡喹酸的最大殘留量為50 μg/kg,恩諾沙星為產(chǎn)蛋雞禁用,其余未作規(guī)定的喹諾酮類抗生素視為不得檢出;土霉素、金霉素和四環(huán)素的最大殘留量為200 μg/kg,強(qiáng)力霉素為產(chǎn)蛋雞禁用。

目前,對食品中喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的前處理方法主要是具有反相或混合模式的固相萃取法(SPE)[6-11],該方法具有快速高效等特點(diǎn),但是由于雞蛋提取液中水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多,在具體操作過程中,往往會出現(xiàn)堵塞篩板、增加操作難度等問題。因此,本文在國家風(fēng)險監(jiān)測手冊和相關(guān)文獻(xiàn)報道的方法[5-11]基礎(chǔ)上,在固相萃取富集凈化之前,采用934-AH玻璃纖維濾紙對提取液進(jìn)行過濾,這樣做可有效地去除大部分油脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),減小了對固相萃取小柱堵塞的影響,凈化過程中可以自然重力過柱,大大提高了工作效率,減小了雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng),建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素的方法,以期為寧夏地區(qū)雞蛋中四環(huán)素類抗生素的殘留分析和確證工作提供參考方法,同時也為提高液質(zhì)聯(lián)用操作能力提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

30份雞蛋 為寧夏省風(fēng)險監(jiān)測項(xiàng)目抽檢樣品,采樣過程符合國家標(biāo)準(zhǔn)要求。雞蛋樣品500 g,去殼,置于塑料保鮮盒中,用一次性筷子充分?jǐn)嚢杌靹?準(zhǔn)確稱取5.00 g充分混勻的雞蛋樣品于50 mL塑料離心管中,待檢,其余樣品密封保存于-20 ℃冰箱中;甲酸 色譜純,美國ACS;甲醇和乙腈 色譜純,德國Merck;磷酸氫二鈉和檸檬酸等 優(yōu)級純,上海國藥集團(tuán);諾氟沙星、氧氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、二氟沙星、惡喹酸、氟甲喹、土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素等11種喹諾酮類和4種四環(huán)素類抗生素 德國Dr. Ehrenstorfer;氧氟沙星-d8、恩諾沙星-d5、沙拉沙星-d8、惡喹酸-d5和氟甲喹-13C3等5種同位素內(nèi)標(biāo) 德國Witega。

LC-20AD UFLC超快速液相色譜儀 日本SHIMADZU;4000 Q-Trap LC-MS/MS 美國AB SCIEX;N-EVAP氮吹儀 美國Organomation;3-30K臺式冷凍離心機(jī) 德國Sigma;漩渦混合器 美國IKA;實(shí)驗(yàn)用超純水 均為Milli-Q超純水儀制備;Oasis HLB固相萃取小柱 美國Waters公司,規(guī)格:200 mg,6 cc;0.2 μm GD/X Nylon多層針頭式濾器和934-AH玻璃纖維濾紙 美國WHATMAN公司,直徑110 mm,1.5 μm。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 試劑和標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 Mcllvaine緩沖溶液的配制:將1000 mL 0.1 mol/L檸檬酸溶液與625 mL 0.2 mol/L磷酸氫二鈉溶液混合,必要時用鹽酸和氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH=4.0±0.5。

0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液的配制:稱取60.5 g乙二胺四乙酸二鈉放入1625 mL 0.1 mol/L Mcllvaine緩沖溶液,振搖溶解即得。

喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制:分別稱取喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì),用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用甲醇稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液(10.0 μg/mL)。用甲醇稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 μg/mL)。

同位素內(nèi)標(biāo)溶液的配制:分別稱取同位素內(nèi)標(biāo),用甲醇配制成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備液。用甲醇稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)中間液(10.0 μg/mL)。用甲醇稀釋配制成標(biāo)準(zhǔn)工作液(1.0 μg/mL)。

1.2.2 樣品前處理 取5.00 g雞蛋樣品,加入1.0 μg/mL同位素內(nèi)標(biāo)工作液40 μL,再加入0.1 mol/L EDTA-Mcllvaine緩沖溶液20 mL,渦旋混勻,超聲提取10 min,4 ℃下12000 r/min離心10 min。雞蛋樣品待凈化液經(jīng)934-AH玻璃纖維濾膜過濾除去部分水溶性蛋白等雜質(zhì),備用。HLB小柱,使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。吸取上述提取液10 mL倒入小柱中(自然重力過柱),待過柱完成后,用6 mL水淋洗,再用6 mL甲醇洗脫,收集洗脫液于試管中,置于氮吹儀上,50 ℃下吹至近干后,用乙腈-0.1%甲酸水(5/95,V/V)定容至1 mL,渦旋混勻30 s,采用0.2 μm GD/X Nylon多層針頭式濾器過濾到進(jìn)樣小瓶中,供LC-MS/MS檢測。

1.2.3 抗生素檢測條件

1.2.3.1 喹諾酮類抗生素的色譜條件 色譜柱:Atlantis T3柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:10.0 μL;流動相:A:0.2%甲酸水,B:乙腈;梯度洗脫程序:0.0～0.5 min:10% A;0.5～3.0 min:10%～60% A;3.0～5.0 min:60%～80% A;5.0～6.0 min:80%～100% A;6.0～7.0 min:100% A;7.0～8.0 min,100%～10% A;8.0～10.0 min,10% A。

1.2.3.2 四環(huán)素類抗生素的色譜條件 Waters Atlantis T3柱(2.1 mm×100 mm,3 μm);柱溫:40 ℃;流速:0.3 mL/min;進(jìn)樣體積:10 μL;流動相:A:0.1%甲酸水,B:乙腈,梯度洗脫程序:0.0～2.5 min:10%～30% A;2.5～5.0 min:30%～90% A;5.0～6.0 min:90%～99% A;6.0～7.0 min:99% A;7.0～9.0 min,99%～10% A;9.0～10.0 min,10% A。

1.2.3.3 質(zhì)譜條件 離子源:電噴霧離子源(ESI);掃描方式:正離子掃描(ESI+);檢測方式:多反應(yīng)監(jiān)測(MRM);氣簾氣(CUR):15 psi;電噴霧電壓(IS):5500 V;離子源溫度(TEM):550 ℃;霧化氣(GS1):40 psi;輔助氣(GS2):40 psi。11種喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素及5種同位素內(nèi)標(biāo)的相關(guān)質(zhì)譜參數(shù)見表1。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)Table 1 Mass spectrometry acquisition parameters

1.2.4 色譜和質(zhì)譜條件的選擇 選擇Waters Atlantis T3柱(2.1×100 mm,3.0 μm)作為分析柱,比較甲醇-水和乙腈-水兩個分離體系的效果。

1.2.5 提取和凈化條件的選擇 比較雞蛋樣品提取液經(jīng)934-AH玻璃纖維濾紙過濾和未經(jīng)過濾對SPE的影響。

1.2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 準(zhǔn)確稱取5.00 g已混勻的基質(zhì)空白樣品,置于50 mL離心管中,分別精密量取適量標(biāo)準(zhǔn)工作液和同位素內(nèi)標(biāo)工作液,按“1.2.2”操作,制備工作曲線溶液。最終的上機(jī)濃度為2.0、5.0、10.0、30.0、50.0、100.0、200和500.0 ng/mL,內(nèi)標(biāo)濃度均為20.0 ng/mL。氧氟沙星、恩諾沙星、沙拉沙星、惡喹酸和氟甲喹等采用同位素內(nèi)標(biāo)法定量,以目標(biāo)組分峰面積與相應(yīng)內(nèi)標(biāo)峰面積的比值Y為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,繪制工作曲線;諾氟沙星、培氟沙星、環(huán)丙沙星、達(dá)氟沙星、洛美沙星、二氟沙星,以及土霉素、金霉素、四環(huán)素和強(qiáng)力霉素等采用外標(biāo)法定量,以目標(biāo)組分峰面積Y為縱坐標(biāo),以標(biāo)準(zhǔn)工作液的濃度X(ng/mL)為橫坐標(biāo),進(jìn)行線性回歸,繪制工作曲線。

1.2.7 加標(biāo)回收率實(shí)驗(yàn) 準(zhǔn)確稱取5.00 g已混勻的不含待測物的基質(zhì)空白樣品,置于50 mL離心管中,分別添加2.0、4.0和20.0 μg/kg 15種藥物進(jìn)行回收率試驗(yàn)。加標(biāo)樣品揮干有機(jī)溶劑,4 ℃下避光保存12 h后,按“1.2.2”方法操作,制備基質(zhì)加標(biāo)溶液。最終上機(jī)濃度為5.0、10.0和50.0 ng/mL,內(nèi)標(biāo)濃度均為20.0 ng/mL。

1.2.8 實(shí)際樣品的檢測 對寧夏省風(fēng)險監(jiān)測項(xiàng)目抽檢的共計(jì)30份雞蛋樣品進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜和質(zhì)譜條件的優(yōu)化

比較了甲醇-水作和乙腈-水兩個分離體系的效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)乙腈-水的分離效果較好。為了進(jìn)一步改善峰形和靈敏度,當(dāng)流動相中含有0.1%的甲酸時,靈敏度較高,峰形較好。因此,本文采用乙腈-0.1%甲酸水溶液作為流動相。

選擇在電噴霧正離子模式下測定11種喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素及5種同位素內(nèi)標(biāo)。先在全掃描模式中獲得準(zhǔn)分子離子[M+H]+,隨后切換到子離子掃描模式,調(diào)節(jié)去簇電壓和碰撞電壓,獲得兩個豐度較高、穩(wěn)定和干擾較小的子離子(見表1)。

2.2 提取和凈化條件的優(yōu)化

經(jīng)研究表明,采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液超聲提取,一定程度減小了喹諾酮類和四環(huán)素類抗生素與金屬的螯合反應(yīng),保證了藥物的游離狀態(tài)和在SPE上的良好保留性,但是雞蛋樣品的水溶性蛋白質(zhì)等雜質(zhì)較多,即使采用緩沖液沉淀蛋白和高速離心等方法,仍然存在大量的雜質(zhì),直接上柱凈化時會堵塞固相萃取小柱,難以自然重力過柱,往往需要給予很大的正壓,增加了前處理過程的難度和時間,而且這樣處理的樣品經(jīng)檢測后發(fā)現(xiàn)有很大的雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng),不利于進(jìn)行定量分析。因此,本文在相關(guān)文獻(xiàn)方法[5-9]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn),在固相萃取富集凈化之前,采用934-AH玻璃纖維濾紙對提取液進(jìn)行過濾,這樣做可有效地去除大部分油脂和蛋白質(zhì)等雜質(zhì),減小了對固相萃取小柱堵塞的影響,凈化過程中可以自然重力過柱,大大提高了工作效率,減小了雜質(zhì)干擾和基質(zhì)效應(yīng)。

2.3 工作曲線、相關(guān)系數(shù)及檢出限

為了消除基質(zhì)效應(yīng)對定量結(jié)果的影響,本文采用標(biāo)準(zhǔn)加入法制作工作曲線。11種喹諾酮類和4種四環(huán)素類抗生素的相關(guān)系數(shù)(r)、檢出限(LOD,S/N=3)和定量限(LOQ,S/N=10)的數(shù)據(jù)見表2。

表2 11種喹諾酮類和4種四環(huán)素類抗生素的線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Regression equations,correlation coefficient,limits of determination and limits of quantification of eleven quinolones and four tetracyclines

2.4 方法的回收率及精密度

結(jié)果表明,三個加標(biāo)水平下喹諾酮類抗生素回收率為80.5%～114.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于12.0%;四環(huán)素類抗生素的平均回收率為84.5%～110.0%,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于10.0%,滿足雞蛋中11種喹諾酮類和4種四環(huán)素類抗生素殘留檢測的要求。

表3 雞蛋中11種喹諾酮類和4 種四環(huán)素類抗生素的加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recovery of standard addition and the relative standard deviation of quinolones and tetracyclines in egg

續(xù)表

2.5 實(shí)際樣品的檢測

用本方法對寧夏省風(fēng)險監(jiān)測項(xiàng)目抽檢的共計(jì)30份雞蛋行了檢測,其中環(huán)丙沙星檢出1份(1/30),含量為10.3 μg/kg;氧氟沙星檢出1份(1/30),含量為1.8 μg/kg;氟甲喹檢出1份(1/30),含量為1.2 mg/kg;恩諾沙星檢出3份(3/30),含量為3.6～9.2 μg/kg;惡喹酸檢出1份(1/30),含量為3.3 μg/kg。根據(jù)235公告,檢出環(huán)丙沙星、氧氟沙星、氟甲喹和恩諾沙星的雞蛋均不符合公告的規(guī)定;檢出氟甲喹的雞蛋未超過公告最大殘留量的規(guī)定[4]。土霉素檢出11份(11/30),含量為1.0～142.8 μg/kg;金霉素檢出3份(3/30),含量為1.6～10.2 μg/kg;四環(huán)素檢出5份(11/30),含量為0.9～1.7 μg/kg;強(qiáng)力霉素檢出12份(12/30),含量為3.4～1600 μg/kg。根據(jù)235公告,檢出土霉素、金霉素和四環(huán)素的雞蛋均未超過公告最大殘留量的規(guī)定;檢出強(qiáng)力霉素的雞蛋不符合公告的規(guī)定[4]。雞蛋陽性樣品的提取離子流圖見圖1。

圖1 雞蛋陽性樣品色譜圖Fig.1 Chromatogram of egg positive samples注:a:氧氟沙星;b:環(huán)丙沙星;c:恩諾沙星;d:惡喹酸;e:氟甲喹;f:金霉素;g:四環(huán)素;h:土霉素;i:強(qiáng)力霉素。

3 結(jié)論

本文采用EDTA-Mcllvaine緩沖溶液提取,玻璃纖維濾膜過濾除雜,HLB固相萃取柱凈化,液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜直接測定了雞蛋中11種喹諾酮類和4種四環(huán)素類抗生素的含量,回收率(80.0%～114.0%)和精密度(<12.0%)符合相關(guān)檢測要求。檢出限(S/N=3)為0.2 μg/kg,定量限(S/N=10)為0.8 μg/kg。該方法快速簡便、靈敏度高、重現(xiàn)性好,對于加強(qiáng)寧夏地區(qū)該項(xiàng)目的監(jiān)測工作具有重要意義。