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(江南大學(xué)食品學(xué)院,江蘇無(wú)錫 214122)

白首烏是蘿藦科鵝絨藤屬植物的塊根,主要產(chǎn)于山東、江蘇和四川等地。江蘇濱海白首烏又稱(chēng)耳葉牛皮消,其含有多種活性成分和人體所有必需氨基酸等[1],具有抗腫瘤、抗衰老和保護(hù)肝臟等功效[2]。目前市售濱海白首烏的產(chǎn)品以首烏干片和精制首烏粉為主,該類(lèi)產(chǎn)品的即食性較差且有明顯的藥材味。此外有研究表明,白首烏在制粉過(guò)程中有大量的營(yíng)養(yǎng)和功效成分隨廢渣和廢液流失,這種做法既浪費(fèi)原料,又污染環(huán)境,從而導(dǎo)致白首烏資源利用不充分、產(chǎn)品的附加價(jià)值降低[3]。

酵素是采用一種或多種原料,經(jīng)有益菌發(fā)酵的含有多種酶和次級(jí)代謝產(chǎn)物等成分的發(fā)酵產(chǎn)品[4],研究表明[5-7]其具有調(diào)節(jié)菌群平衡、清除體內(nèi)垃圾和延緩衰老等功效。Feng等[8]對(duì)不同酵素進(jìn)行了綜述,表明植物酵素不僅對(duì)人類(lèi)健康有益,還可以促進(jìn)工業(yè)發(fā)展,其相關(guān)產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)具有潛在的發(fā)展前景。蔣增良等[9]從葡萄酵素中分離得到8株優(yōu)勢(shì)酵母菌;張夢(mèng)梅等[10]的研究表明,天然植物酵素的優(yōu)勢(shì)菌種為酵母菌、醋酸菌和乳酸菌。乳酸菌發(fā)酵可以產(chǎn)生易于人體吸收的氨基酸和乳酸菌素等物質(zhì)[11],并能提供大量的活菌,有利人體消化和促進(jìn)腸道健康,此外還可以改善白首烏的藥材味道;酵母菌發(fā)酵可以產(chǎn)SOD,該酶可以清除體內(nèi)的超氧離子自由基,具有較強(qiáng)的抗氧化和抗衰老等作用;而醋酸菌發(fā)酵產(chǎn)生乙酸,不利于產(chǎn)品的風(fēng)味,故選用乳酸菌和酵母菌作為本實(shí)驗(yàn)的發(fā)酵菌種。

本文首次以純白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì),利用乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵研發(fā)了一種含有大量活菌的新型白首烏酵素。將鮮白首烏塊根或首烏干片經(jīng)蒸煮、打漿、雙酶法水解和離心得到白首烏清汁,利用乳酸菌和酵母菌發(fā)酵制備酵素,此工藝可以有效減少白首烏傳統(tǒng)制粉過(guò)程中營(yíng)養(yǎng)和功效成分的損失。另外,乳酸菌和酵母菌發(fā)酵分別賦予了產(chǎn)品大量的活性乳酸菌和功效酶,同時(shí)也極大地改善了白首烏的不良風(fēng)味。此外,高附加值產(chǎn)品的研發(fā)為江蘇濱海白首烏資源的開(kāi)發(fā)利用提供了一定的理論依據(jù),對(duì)促進(jìn)白首烏產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

鮮白首烏塊根、白首烏干片 江蘇鹽城陳氏食品有限公司;α-淀粉酶(酶活力2000 U/g)、糖化酶(酶活力100000 U/mL) 北京伊諾凱科技有限公司;嗜酸乳桿菌(Lactobacillusacidophilus,簡(jiǎn)稱(chēng)LA)、植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum,簡(jiǎn)稱(chēng)LP)、保加利亞乳桿菌(Lactobacillusbulgaricus,簡(jiǎn)稱(chēng)LB)和嗜熱鏈球菌(Streptococcusthermophilus,簡(jiǎn)稱(chēng)ST) 食品生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供;安琪酵母1(S1)、安琪酵母2(S2)、新良酵母(S3)、梅山酵母(S4)、尤樂(lè)博酵母(EDY) 市售;其余試劑 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FA2204B電子天平 上海第二天平廠;九陽(yáng)料理機(jī) 山東九陽(yáng)小家電有限公司;FA25實(shí)驗(yàn)室高剪切分散乳化機(jī) 上海弗魯克科技發(fā)展有限公司;501型超級(jí)恒溫水浴 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;JJ-1型定時(shí)電動(dòng)攪拌器 江蘇金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠;WZS-Ⅰ型阿貝折光儀 上海實(shí)驗(yàn)儀器廠;CR21GIII高速離心機(jī) 天美(中國(guó))科學(xué)儀器有限公司;EL20型實(shí)驗(yàn)室pH計(jì) 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;ZHJH-C1209C超凈工作臺(tái) 上海智城分析儀器制造有限公司;THZ-85B氣浴恒溫振蕩器 常州翔天實(shí)驗(yàn)儀器廠;DHG型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;T722型分光光度計(jì) 上海精密儀器廠;血球計(jì)數(shù)板 丹陽(yáng)市健陵醫(yī)療器械有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 工藝流程

1.2.2 操作要點(diǎn)

1.2.2.1 白首烏漿料的制備 將鮮白首烏清洗干凈,去皮并切成塊狀,厚度為2～3 cm;白首烏干片以1∶3的料水比在50 ℃下復(fù)水75 min。切塊后的鮮白首烏或復(fù)水后的白首烏片于100 ℃下蒸煮30 min后按1∶9的料水比打漿,然后采用高剪切分散乳化機(jī)以10000 r/min的轉(zhuǎn)速乳化10 s,重復(fù)三次,得到漿料。

1.2.2.2 雙酶法水解 采用α-淀粉酶和糖化酶進(jìn)行水解。液化條件為:α-淀粉酶添加量14 U/g、pH6.0、酶解溫度65 ℃、時(shí)間60 min;糖化條件為:加酶量160 U/g、pH4.5、溫度55 ℃、時(shí)間60 min。

1.2.2.3 發(fā)酵基質(zhì)的制備 白首烏漿料酶解液于高速離心機(jī)中以8000 r/min離心30 min,得到白首烏清汁,然后調(diào)節(jié)清汁pH至6.0并滅菌備用。

1.2.2.4 菌種的活化與培養(yǎng) 乳酸菌的活化:取4 ℃下斜面保存的LA、LP、LB和ST于MRS培養(yǎng)基中,37 ℃下活化24 h,菌液待用。酵母菌活化:取一定量的干酵母于十倍體積的葡萄糖溶液(體積分?jǐn)?shù)為5%)中,35 ℃下活化30 min,菌液待用。

1.2.2.5 接種與發(fā)酵 乳酸菌發(fā)酵:在白首烏清汁中分別接種3%的LA和LP,37 ℃發(fā)酵36 h,LB和ST的接種量為2%,其他條件相同。酵母菌發(fā)酵:在30 ℃、pH6.0的條件下,接種0.2%的酵母菌于裝有40 mL白首烏清汁的250 mL錐形瓶中,以130 r/min振蕩發(fā)酵24 h。按照1.2.5進(jìn)行復(fù)合發(fā)酵,復(fù)合發(fā)酵結(jié)束后在4～8 ℃下低溫靜置12 h后發(fā)酵,使發(fā)酵液產(chǎn)香,得到白首烏酵素。

1.2.3 乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵 為了更準(zhǔn)確地獲得乳酸菌在白首烏清汁這種全新體系中的生長(zhǎng)特點(diǎn)和基礎(chǔ)發(fā)酵參數(shù),本實(shí)驗(yàn)以LA、LP、LB和ST為乳酸菌發(fā)酵的菌種,在白首烏清汁中進(jìn)行乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。因?yàn)樯鲜鏊姆N菌在白首烏清汁中生長(zhǎng)較好,活菌數(shù)量較高,所以以活菌數(shù)為乳酸菌發(fā)酵的主要評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)菌種的發(fā)酵時(shí)間和接種量進(jìn)行優(yōu)化,然后選擇兩種較優(yōu)的乳酸菌進(jìn)行配比發(fā)酵,確定最佳的復(fù)配比例。

1.2.3.1 發(fā)酵時(shí)間的確定 調(diào)整清汁初始pH為6.0,LA和LP以3%的接種量,在37 ℃下分別發(fā)酵6、12、18、24、30、36 h,結(jié)束后測(cè)定發(fā)酵液中乳酸菌活菌數(shù)。LB和ST的接種量為2%,其它條件同上。

1.2.3.2 接種量的確定 保證初始pH6.0、發(fā)酵溫度37 ℃不變,LB、ST、LA和LP分別發(fā)酵12、18、18、30 h,探究不同接種量(1%、1.5%、2%、2.5%、3%、3.5%)對(duì)活菌數(shù)的影響。

1.2.3.3 菌種復(fù)配發(fā)酵 由于上述得到的LA和LP的最佳發(fā)酵時(shí)間不同,故以3%的接種量,將LA和LP按照不同的比例(3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3)在37 ℃下分別發(fā)酵18、24、30 h,以活菌數(shù)為指標(biāo),確定復(fù)配比例和發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4 酵母菌單獨(dú)發(fā)酵 為了更好地獲取酵母菌在白首烏汁中的生長(zhǎng)特點(diǎn)和發(fā)酵參數(shù),故以白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì)進(jìn)行酵母菌單獨(dú)發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。酵母菌是兼性厭氧型微生物,其發(fā)酵過(guò)程有有氧發(fā)酵和無(wú)氧發(fā)酵兩個(gè)階段,本文采用酵母菌發(fā)酵主要是為了得到較高的SOD活力,但由于無(wú)氧發(fā)酵會(huì)產(chǎn)生乙醇,而本課題后期會(huì)對(duì)產(chǎn)品的解酒功效進(jìn)行研究,發(fā)酵液中乙醇含量越低越有利,所以將SOD活力和乙醇含量作為酵母菌發(fā)酵的主要評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1.2.4.1 發(fā)酵菌種和發(fā)酵時(shí)間的確定 以白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì),選擇5種不同來(lái)源的酵母菌(S1、S2、S3、S4、EDY)進(jìn)行實(shí)驗(yàn),在初始pH6.0、裝瓶量40 mL、接種量0.2%、發(fā)酵溫度30 ℃的條件下,于130 r/min的搖床中分別發(fā)酵12、16、20、24、28 h,以SOD活力和乙醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),確定最佳發(fā)酵菌種及其發(fā)酵時(shí)間。

1.2.4.2 接種量的確定 以S4為發(fā)酵菌種,在初始pH6.0、裝瓶量40 mL,30 ℃下發(fā)酵24 h,探究不同接種量(0.05%、0.1%、0.15%、0.2%、0.25%、0.3%)對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.3 初始pH的確定 保證裝瓶量40 mL不變,以0.2%接種量,30 ℃下發(fā)酵24 h,探究不同初始pH(5.0、5.5、6.0、6.5、7.0)對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.4 裝瓶量的確定 酵母菌是需氧型菌種,體系含氧量對(duì)產(chǎn)酶能力影響較大,故在初始pH5.0、接種量0.2%、發(fā)酵溫度為30 ℃和發(fā)酵時(shí)間24 h不變的條件下,改變裝瓶量(30、40、50、60、70 mL),探究其對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.4.5 蛋白胨添加量的確定 在裝瓶量30 mL,初始pH5.0、接種量0.2%不變的條件下,30 ℃下發(fā)酵24 h,探究不同蛋白胨添加量(0、0.4%、0.8%、1.2%、1.6%、2.0%)對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響。

1.2.5 復(fù)合發(fā)酵 乳酸菌和酵母菌復(fù)合發(fā)酵有以下三種方法:a. 在初始pH為6.0的白首烏清汁中同時(shí)接種3%的復(fù)合乳酸菌與0.2%的S4,37 ℃下一起發(fā)酵一定的時(shí)間;b. 先接種3%復(fù)合乳酸菌,37 ℃發(fā)酵24 h,再接種0.2%的S4,30 ℃發(fā)酵一定的時(shí)間;c. 先接種0.2%的S4,30 ℃下發(fā)酵24 h,再接種3%復(fù)合乳酸菌,37 ℃下發(fā)酵至特定的時(shí)間。以乳酸菌活菌數(shù)、SOD活力、酵母菌活菌數(shù)和乙醇含量為評(píng)價(jià)指標(biāo),對(duì)上述三種方法進(jìn)行研究,確定最佳的接種順序及該順序下的發(fā)酵時(shí)間。

1.2.6 指標(biāo)測(cè)定

1.2.6.1 乳酸菌的測(cè)定 參照GB 4789.35-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)乳酸菌檢驗(yàn)》[12]測(cè)定。

1.2.6.2 酵母菌的測(cè)定 采用血球計(jì)數(shù)板法[13],具體操作步驟為:首先,用75%的酒精和蒸餾水擦拭血球計(jì)數(shù)板(1 mm×1 mm,25×16型計(jì)數(shù)室),并用擦鏡紙擦干待用;其次,用吸管吸取一滴菌液(含亞甲基藍(lán)染色劑)于蓋玻片的邊緣,使菌液緩緩滲入,多余的菌液用吸水紙吸干,待酵母菌完全沉入計(jì)數(shù)室后用顯微鏡找到視野;最后,以計(jì)數(shù)室左上、左下、右上和右下4個(gè)中方格(100個(gè)小方格)的酵母菌數(shù)計(jì)數(shù),每個(gè)樣品計(jì)數(shù)三次并取平均值,根據(jù)公式:酵母菌數(shù)(mL)=每個(gè)中方格中酵母菌的平均數(shù)×稀釋倍數(shù)×2.5×105計(jì)算酵母菌活菌數(shù)量。

1.2.6.3 pH 采用pH計(jì)測(cè)定發(fā)酵液的pH,按照說(shuō)明書(shū)操作。

1.2.6.4 SOD活力的測(cè)定 按每克酵母濕菌體加入0.8 mL甲苯,35 ℃下破壁45 min,然后加入5 mL pH7.8的磷酸緩沖液(含0.1 mmol/L EDTA)提取5 h,再以4000 r/min離心5 min,分離出水相,10000 r/min離心15 min,收集上清液即為SOD粗提取液[14]。測(cè)定方法按照GB/T 5009.171-2003《保健食品中超氧化物歧化酶(SOD)活性的測(cè)定》[15]。

1.2.6.5 乙醇含量的測(cè)定 重鉻酸鉀分光光度法[16],具體操作如下:取兩支10 mL的比色管,一支加入0.5 mL的樣品,另一支以等量的蒸餾水代替,然后再加入2 mL的5%的重鉻酸鉀溶液,加水至刻度線(xiàn),100 ℃水浴10 min,取出后立即冷卻,靜置5 min,以空白管校零,用1 cm比色皿于波長(zhǎng)600 nm處測(cè)定吸光值。以無(wú)水乙醇為對(duì)照品,配制0.2 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液,并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn),回歸方程為A=0.3668x+0.0001,相關(guān)系數(shù)為R2=0.9992。乙醇含量(g/L)=(A-0.0001)/(0.3668×0.5)×稀釋倍數(shù)。

1.2.7 數(shù)據(jù)處理 每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,采用Origin 9.0進(jìn)行數(shù)據(jù)處理并作圖,SPSS 21.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,用單因素方差分析(Duncan)對(duì)各組數(shù)據(jù)之間的差異顯著性進(jìn)行分析,以p<0.05作為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵

2.1.1 發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖1可知,不同種類(lèi)的乳酸菌達(dá)到最大活菌時(shí)的時(shí)間不完全相同,這與菌種本身的特性有關(guān)。LB發(fā)酵12 h時(shí),活菌數(shù)達(dá)到最大,而且此時(shí)的活菌數(shù)高于其他三種菌,說(shuō)明LB遲緩期較短,能盡快進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。LA和ST的活菌數(shù)均在18 h時(shí)達(dá)到最大,LA的最大活菌數(shù)高于ST。LP發(fā)酵30 h時(shí)才達(dá)到最大活菌數(shù),雖然發(fā)酵時(shí)間最長(zhǎng),但此時(shí)的活菌數(shù)與LA相近,高于LB和ST的最大活菌數(shù)。綜上可知,LB、LA、ST和LP的最佳發(fā)酵時(shí)間分別為12、18、18和30 h。

圖1 不同菌種的發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of fermentation time of different strains on viable LAB counts 注:LA為嗜酸乳桿菌,LP為植物乳桿菌,LB為保加利亞乳桿菌,ST為嗜熱鏈球菌；圖2和圖3同。

2.1.2 接種量的確定 由圖2可知,不同菌種達(dá)到最大活菌數(shù)時(shí)的接種量各不相同,這是不同菌種的特性決定的。當(dāng)接種量為1.5%時(shí),ST的活菌數(shù)最高,說(shuō)明其最適接種量為1.5%。雖然LB在接種量為2%時(shí)活菌數(shù)達(dá)到最大,但其活菌數(shù)仍比LA和LP低。LA和LP的最佳接種量均為3%,而且兩種菌的生長(zhǎng)趨勢(shì)相近,活菌數(shù)均較高。綜上可知,ST、LB、LA和LP的最佳接種量分別為1.5%、2%、3%和3%。

圖2 不同菌種的接種量對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of inoculation of different strains on viable LAB counts

由2.1.1和2.1.2的結(jié)果可以看出,雖然ST和LB達(dá)到最大活菌時(shí)的接種量小于LA和LP,這有利于節(jié)約成本,但LA和LP的活菌數(shù)明顯高于LB和ST,活菌越多對(duì)產(chǎn)品越有利,考慮到不同乳酸菌之間可能存在共生作用,所以將LA和LP這兩種生長(zhǎng)較好的乳酸菌進(jìn)行復(fù)配發(fā)酵,期望得到較高的活菌數(shù)。LA和LP單獨(dú)發(fā)酵時(shí)均在3%的接種量下生長(zhǎng)最好,接種量增大時(shí)活菌數(shù)減少,說(shuō)明白首烏清汁中乳酸菌的總接種量為3%較合適,因此確定3%為復(fù)配發(fā)酵的總接種量。

2.1.3 復(fù)配比例和復(fù)配發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖3可以看出,當(dāng)以不同的比例發(fā)酵18 h時(shí),LA所占的比例越大,活菌數(shù)越高,因?yàn)榇藭r(shí)LA的生長(zhǎng)速率比LP快,活菌數(shù)積累較多。當(dāng)以不同的比例發(fā)酵30 h時(shí),LA可能處于穩(wěn)定期甚至衰退期,此時(shí)LP生長(zhǎng)速率較快,所以LP所占比例越大,活菌數(shù)量越高。當(dāng)LA∶LP為1∶1時(shí),發(fā)酵24 h得到的活菌數(shù)高于18 h和30 h時(shí)的活菌數(shù),其他比例下24 h的活菌數(shù)基本處于兩者之間。無(wú)論發(fā)酵18 h、24 h,還是30 h時(shí),當(dāng)LA和LP以1∶1發(fā)酵時(shí),其活菌數(shù)始終是該時(shí)間下的最高值,可能是兩菌間存在共生作用,所以LA和LP的最佳配比為1∶1,最適發(fā)酵時(shí)間為24 h。

圖3 菌種比例和發(fā)酵時(shí)間對(duì)乳酸菌活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of strains proportion and fermentation time on viable LAB counts

2.2 酵母菌單獨(dú)發(fā)酵

2.2.1 發(fā)酵菌種和發(fā)酵時(shí)間的確定 由圖4可知,同一發(fā)酵時(shí)間下,不同菌種的SOD酶活力有顯著性差異(p<0.05)。隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),不同菌種的酶活力均呈一定的增長(zhǎng)趨勢(shì),其中S4的SOD活力始終高于其他4種酵母菌,故選用S4為本實(shí)驗(yàn)酵母菌發(fā)酵的菌種。由圖5可以看出,當(dāng)發(fā)酵時(shí)間小于24 h時(shí),隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),發(fā)酵液中SOD活力顯著增加(p<0.05),在24 h時(shí)達(dá)到最大值后基本維持不變(p>0.05)。酵母菌發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生乙醇,在0～20 h之間,乙醇含量呈明顯上升趨勢(shì)(p<0.05),可能是因?yàn)榻湍妇臄?shù)量隨發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增加,致使發(fā)酵液中氧氣含量減少,從而導(dǎo)致酵母菌無(wú)氧發(fā)酵產(chǎn)乙醇的速率增加。由于發(fā)酵24 h后發(fā)酵液中SOD活力不再增加,所以將酵母菌的發(fā)酵時(shí)間定為24 h。

圖4 發(fā)酵時(shí)間對(duì)不同菌種SOD活力的影響Fig.4 Effect of fermentation time on SOD activity of different strains注:S1、S2、S3、S4、EDY分別表示安琪酵母1、安琪酵母2、新良酵母、梅山酵母和尤樂(lè)博酵母。不同字母為同一時(shí)間下不同菌種之間的差異,字母不同表明差異顯著,p<0.05。

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響Fig.5 Effect of fermentation time on SOD activity and ethanol content 注:圖中字母不同表示差異顯著,p<0.05；圖6～圖9同。

2.2.2 酵母菌接種量的確定 由圖6可知,隨著酵母菌接種量的增加,發(fā)酵液中SOD活力呈先升后降的趨勢(shì),接種量為0.2%時(shí),發(fā)酵液中SOD活力顯著高于其他組(p<0.05),說(shuō)明酵母菌發(fā)酵產(chǎn)SOD的最佳接種量為0.2%。乙醇含量隨接種量的增加逐漸降低(p<0.05),可能是由于接種量增加,酵母菌的生長(zhǎng)受到發(fā)酵液中營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的限制,其死亡速率高于生長(zhǎng)速率,酵母菌的活菌數(shù)逐漸減少,無(wú)氧發(fā)酵速率降低,最終導(dǎo)致乙醇含量降低。當(dāng)接種量為0.2%時(shí),SOD活力最高,故確定酵母菌的接種量為0.2%。

圖6 酵母菌接種量對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響Fig.6 Effect of inoculation quantity on SOD activity and ethanol content

2.2.3 初始pH的確定 由圖7可知,發(fā)酵液中SOD活力隨初始pH的增加呈顯著下降趨勢(shì)(p<0.05),乙醇含量也隨之降低(p<0.05),可能是較高的pH抑制了酵母菌的生長(zhǎng),使活菌數(shù)減少,產(chǎn)酶能力降低,從而導(dǎo)致發(fā)酵液中SOD活力和乙醇含量都逐漸降低。當(dāng)初始pH為5.0時(shí),發(fā)酵液中SOD活力達(dá)到最大,由于酵母菌發(fā)酵結(jié)束后要接種乳酸菌,若初始pH太低則不利于后期乳酸菌發(fā)酵,所以確定初始pH為5.0。

圖7 初始pH對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響Fig.7 Effect of initial pH on SOD activity and ethanol content

2.2.4 裝瓶量的確定 由圖8可知,隨著裝瓶量的增加,SOD活力顯著下降(p<0.05),乙醇含量呈上升趨勢(shì)(p<0.05),可能是氧氣含量的減少抑制了酵母菌的生長(zhǎng),無(wú)氧發(fā)酵速率加快,從而導(dǎo)致了SOD活力降低和乙醇含量升高。由此可以看出,溶氧量對(duì)酵母菌發(fā)酵有較大的影響,增加溶氧量即降低裝瓶量有利于酵母菌產(chǎn)酶,考慮到經(jīng)濟(jì)情況,本實(shí)驗(yàn)將裝瓶量確定為30 mL。

圖8 裝瓶量對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響Fig.8 Effect of bottling capacity on SOD activity and ethanol content

2.2.5 蛋白胨添加量的確定 由圖9可以看出,隨著蛋白胨添加量的增大,發(fā)酵液中SOD活力呈先升后降的趨勢(shì)(p<0.05),當(dāng)添加1.2%的蛋白胨時(shí),發(fā)酵液中SOD活力達(dá)到最大值。添加一定量的蛋白胨有利于酵母菌生長(zhǎng),從而促進(jìn)其產(chǎn)酶。當(dāng)?shù)鞍纂颂砑恿看笥?.2%時(shí),可能是因?yàn)榘l(fā)酵液中C:N降低,抑制了酵母菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)SOD,使發(fā)酵液中SOD活力降低,乙醇含量增加。綜上可知,蛋白胨添加量為1.2%較合適。

圖9 蛋白胨添加量對(duì)SOD活力和乙醇含量的影響Fig.9 Effect of peptone addition on SOD activity and ethanol content

2.3 復(fù)合發(fā)酵

因?yàn)槿樗峋徒湍妇淖钸m生長(zhǎng)溫度和需氧情況相差較大,所以方法a不合適;又經(jīng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),按方法b發(fā)酵,酵母菌生長(zhǎng)明顯不良,應(yīng)該是乳酸菌利用發(fā)酵液中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的速度比酵母菌快,且過(guò)度發(fā)酵會(huì)使乳酸菌死亡。因此,為獲得高SOD活力和大量乳酸菌活菌,采用方法c,先接種酵母菌發(fā)酵產(chǎn)酶,再接種乳酸菌,使其發(fā)酵提供活菌并改善風(fēng)味。

酵母菌發(fā)酵24 h結(jié)束后,發(fā)酵液pH為4.8,此時(shí)再接入乳酸菌發(fā)酵。由圖10A可知,酵母菌活菌數(shù)在0～36 h不斷增大,其數(shù)量在36 h時(shí)達(dá)到最大值后呈下降趨勢(shì),乳酸菌活菌數(shù)量逐漸增加。由圖10B可知,SOD活力在24 h時(shí)達(dá)到最大值后基本維持不變。接入乳酸菌后乙醇含量逐漸下降,有可能是因?yàn)槿樗峋l(fā)酵產(chǎn)生乳酸和其他物質(zhì),促進(jìn)了乙醇的分解。此外,乙醇是一種親神經(jīng)性物質(zhì),容易轉(zhuǎn)化成自由基,而SOD是清除自由基的重要酶類(lèi)[17,18],36 h后酵母菌活菌數(shù)減少,其產(chǎn)乙醇的速率隨之降低,此時(shí)SOD間接促進(jìn)乙醇分解的速率大于乙醇產(chǎn)生的速率,所以發(fā)酵液中乙醇含量降低。由于本課題組后期會(huì)對(duì)白首烏酵素的解酒護(hù)肝功效進(jìn)行研究,故乙醇含量越低對(duì)后面研究越有利。隨著總發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng),乳酸菌活菌數(shù)不斷增加,SOD活力保持最大值不變且乙醇含量不斷降低,雖然酵母菌活菌數(shù)下降,但其含量依然較高,故確定總發(fā)酵時(shí)間為60 h,乳酸菌的發(fā)酵時(shí)間為36 h。

圖10 復(fù)合發(fā)酵對(duì)發(fā)酵液的影響Fig.10 Effect of complex fermentation on fermentation broth

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)乳酸菌單獨(dú)發(fā)酵的條件(發(fā)酵時(shí)間、接種量和菌種復(fù)配比例)和酵母菌單獨(dú)發(fā)酵的條件(菌種、發(fā)酵時(shí)間、接種量、初始pH、裝瓶量和蛋白胨添加量)分別進(jìn)行了優(yōu)化,確定將LA和LP以1∶1 (v∶v)的比例混合作為乳酸菌發(fā)酵的菌種,并確定采用先接種酵母菌后接種乳酸菌發(fā)酵的方式得到的乳酸菌活菌數(shù)和SOD活力較優(yōu),在該順序下得到的最佳復(fù)合發(fā)酵條件為:在初始pH5.0、添加1.2%的蛋白胨和裝瓶量為30 mL(250 mL)的條件下,先接種0.2%的S4,30 ℃下振蕩發(fā)酵24 h。酵母菌發(fā)酵結(jié)束后,再接種3%的復(fù)合乳酸菌(LA和LP的比例為1∶1 (v∶v)),37 ℃靜置發(fā)酵36 h,最后于4～8 ℃低溫后發(fā)酵12 h產(chǎn)香。在此條件下,最終酵素中乳酸菌活菌為2.61×108CFU/mL,酵母菌活菌數(shù)為7.9×107CFU/mL,SOD活力為4.23×104U/L。本文首次以純白首烏清汁為發(fā)酵基質(zhì),采用有益菌發(fā)酵的方法研制了一款新型的白首烏產(chǎn)品,該產(chǎn)品含有的大量活菌和功效酶,不僅提高了白首烏產(chǎn)品的附加值,還有利于當(dāng)?shù)禺a(chǎn)業(yè)的發(fā)展。