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(1.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院,內(nèi)蒙古呼和浩特 010018; 2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)職業(yè)技術(shù)學(xué)院,內(nèi)蒙古包頭 014109)

近幾年來,食源性疾病引起的食物中毒事件不斷發(fā)生,食品安全問題受到了國內(nèi)外廣泛關(guān)注。據(jù)世界衛(wèi)生組織(WHO)報道,每年食源性疾病高達30%。這些由病原菌引起的食品安全問題中,65%是因為病原菌形成生物被膜造成的[1]。細菌生物被膜(biofilm)是菌體為適應(yīng)脅迫環(huán)境,粘附于物體或者人體組織表面,通過分泌大量的多糖、蛋白質(zhì)和核酸等胞外基質(zhì)將自身包裹在其中而形成的聚集膜樣物[2]。生物被膜會形成牙菌斑等危及人類健康,還會對食品加工設(shè)備、加工廠地板和墻壁表面造成污染[3]。相較于單個的浮游細菌,生物被膜的形成會對抗生素和宿主免疫系統(tǒng)產(chǎn)生更強的抵抗力。因此,生物被膜形成機制的研究一直是國內(nèi)外學(xué)者關(guān)注的重點領(lǐng)域[4]。

細菌生物被膜的研究一直集中于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中,直到1988年Dodd等[5]從雞肉加工廠的脫毛器械中發(fā)現(xiàn)了金黃色葡萄球菌生物被膜,并發(fā)現(xiàn)它們對抗菌劑有較強抵抗力,至此食源性病原菌生物被膜會造成食品腐敗的問題被廣泛關(guān)注。Herald等[6]使用掃描電子顯微鏡(SEM)研究了單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)于10、21、35 ℃下在不銹鋼表面的附著程度,發(fā)現(xiàn)微生物細胞在三個溫度下均可粘附,又進一步發(fā)現(xiàn)食品的加工地板、輸送管道上極易形成單核細胞增多性李斯特氏菌生物被膜,給食品加工安全造成巨大隱患。Giaouris等[7]發(fā)現(xiàn),在肉類加工過程中,潛在的致病菌會粘附在食物接觸表面形成生物被膜,從而導(dǎo)致產(chǎn)品發(fā)生交叉污染、保質(zhì)期降低等問題。隨著不斷的研究發(fā)現(xiàn),不僅革蘭氏陽性菌會形成生物被膜,大腸桿菌(Escherichiacoli)、沙門氏菌(Salmonella)、單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)等食源性革蘭氏陰性菌也會形成生物被膜。

食品加工環(huán)境中,病原菌的持續(xù)存在是造成食源性疾病發(fā)生的主要因素,并被認為對公共健康有重大影響。食品加工環(huán)境會為生物被膜的形成提供有利條件,例如水分、營養(yǎng)物質(zhì)等。在這樣的有利條件下,細菌可以粘附于食品接觸表面繁殖并形成生物被膜,從而危及食品的質(zhì)量和安全性[8]。目前,研究人員主要致力于單一菌種生物被膜的形成特性及抑制清除生物被膜方法的研究,對混合病原菌生物被膜的研究較少。但存在于自然界中的大多是多種病原菌形成的混合病原菌生物被膜,其結(jié)構(gòu)成分更為復(fù)雜,抵抗外界不良環(huán)境能力加強,一旦達到成熟期很難被完全清除。因此,研究混合病原菌生物被膜的形成特性和菌間相互作用機制至關(guān)重要。

本文在現(xiàn)有的研究基礎(chǔ)上,歸納總結(jié)了食源性混合菌生物被膜的形成規(guī)律及混合菌生物膜中菌種間的相互作用,初步探討了群體感應(yīng)在混合菌生物膜中的作用,以期為食品領(lǐng)域應(yīng)對和破解食源性混合菌生物被膜污染問題提供啟示。

1 生物被膜的形成

生物被膜的形成是一個動態(tài)且非常迅速的過程。與同種微生物的浮游狀態(tài)相比,生物被膜的形成過程是十分復(fù)雜的。此過程會產(chǎn)生物理、化學(xué)、生物反應(yīng),細胞間會通過特殊類型的信號傳遞以及不同組基因的轉(zhuǎn)錄進行聯(lián)系[9]。遺傳學(xué)研究表明,形成混合菌生物被膜會經(jīng)過五個階段:第一階段是細菌表面的特異性蛋白等物質(zhì)選擇性的粘附于物體表面而發(fā)生的可逆粘附,處于粘附期的細菌狀態(tài)不穩(wěn)定,因此可在此階段及時進行清除[10]。第二階段是細菌通過自身分泌的胞外聚合物或鞭毛介導(dǎo)而發(fā)生的不可逆粘附,通過靜電作用產(chǎn)生的附著力不僅將微生物細胞附著于生物材料表面,還會加強生物膜內(nèi)微生物細胞間的凝聚力[11]。第三階段是發(fā)展期,通過胞外多糖內(nèi)的特定化學(xué)信號分子,細菌群落不斷聚集,使得生物被膜不斷加厚,生物被膜中的細菌菌落通常是由多種類型的微生物群落組成的混合生物被膜,混合生物被膜的形成為不同微生物的相互依賴生長提供了良好環(huán)境[12]。第四階段的微生物間會通過自體誘導(dǎo)物信號進行交流,并分泌大量胞外多聚糖,以形成高度有組織的成熟生物被膜,此階段的生物被膜已達到穩(wěn)定狀態(tài),對外界抵抗力達到最強,且最難以被清除[13]。第五階段是混合生物被膜內(nèi)的一部分微生物開始脫落,在脫落過程中,生物膜內(nèi)的微生物會產(chǎn)生不同的糖分解酶,以幫助被釋放的微生物重新粘附于物體表面形成新的生物被膜[14]。通過這五個階段,微生物在混合生物被膜內(nèi)完成了粘附、發(fā)展、成熟、脫落、重新粘附的循環(huán)過程。

2 生物膜內(nèi)菌種間的相互作用

食品加工環(huán)境中的微生物種類繁多,且均可以在固體表面形成生物被膜。這種多樣性使得它們之間以不同的相互作用關(guān)系構(gòu)成了復(fù)雜的混合菌生物被膜。越來越多的研究表明,多物種生物被膜對抗生素的抵抗力要明顯高于單一種類的抵抗力[21]。Van等[22]研究發(fā)現(xiàn),單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)形成的混合生物被膜對苯扎氯銨和過乙酸的抗性要明顯強于其單一菌的耐藥性。因此,研究混合菌生物被膜形成特性及其種間相互作用關(guān)系尤為重要。根據(jù)學(xué)者們的研究可知,在食源性混合病原菌生物被膜中,菌種間的主要相互作用是共生和競爭。

2.1 共生作用

共生又叫互利共生,是多種生物相互分工合作,缺此失彼都不能生存的一類種間關(guān)系[23]?；旌暇锬ぶ械奈⑸镩g也存在共生作用,這種種間的相互促進作用會增強細菌對固體表面的附著力。Wang等[24]對食源性病原菌腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、血清型鼠傷寒沙門氏菌(SalmonellaentericaserovarTyphimurium)和產(chǎn)志賀毒素大腸桿菌(Shigatoxin-producingEscherichiacoli)O157∶H7形成的單種生物膜及其混合菌生物被膜進行研究發(fā)現(xiàn),一是細菌生物被膜比浮游菌對消毒作用的抵抗力更強;二是具有負胞外多糖表達的沙門氏菌和大腸桿菌菌株形成的混合病原菌生物被膜比單菌株生物膜更具耐藥性,表明細菌間的互利共生作用加強了生物膜的抵抗力。Zhang等[25]發(fā)現(xiàn)了銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)的生長可以保證黃桿菌(Flavobacterium)進入混合菌生物被膜有利區(qū)域。Ibusquiza等[26]通過對不同情況下單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)和惡臭假單胞菌(Pseudomonasputida)形成的混合菌種生物膜與相應(yīng)的單菌種生物膜微觀結(jié)構(gòu)進行比較得出,惡臭假單胞菌與單核細胞增多性李斯特氏菌的關(guān)聯(lián)關(guān)系加速了生物被膜的形成。Kai等[27]通過熒光標記法發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)形成的雙菌種生物被膜與單種生物被膜空間結(jié)構(gòu)和豐富度都不同?；旌想p菌種生物被膜對抗菌劑(十二烷基硫酸鈉、抗壞血酸)均比單一菌種抵抗力強。至關(guān)重要的發(fā)現(xiàn)是,雙菌種間的互利共生作用對生物被膜起到了保護作用,而不是某一單一菌的選擇性抵抗力發(fā)揮作用。Sancbhezvizuete等[28]研究發(fā)現(xiàn),枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)能夠保護金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)不受殺菌劑作用。在此雙菌種生物膜中,枯草芽孢桿菌中的ypqP基因會增強生物被膜對殺菌劑的耐受性,以起到保護金黃色葡萄球菌的作用。Ren等[29]研究發(fā)現(xiàn),嗜根寡養(yǎng)單胞菌(Stenotrophomonasrhizophila)、黃單胞菌(Xanthomonas)、氧化微桿菌(Microbacteriumoxydans)和解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)四種菌在混合生物被膜中表現(xiàn)出超強的協(xié)調(diào)作用。在特定的體外環(huán)境中,只有黃單胞菌可以單獨形成生物被膜。但由于協(xié)同效應(yīng),四種菌可共同形成混合菌生物被膜,且個體菌株數(shù)量明顯高于單種生物被膜。由此可見,生物被膜內(nèi)多菌株的共生作用可以促進胞外多糖等基質(zhì)的產(chǎn)生聚集?；|(zhì)凝聚力的加強不僅會增加生物膜內(nèi)群落的多樣性,還會增強菌株的粘附力,從而增強了生物膜的持久性和耐藥性。

2.2 競爭作用

混合病原菌生物被膜內(nèi)的微生物種間不僅存在互利共生作用,還存在競爭作用。競爭作用是指在營養(yǎng)物、最適生長環(huán)境等微生物生長的必需條件不足時,微生物間會發(fā)生爭奪,或通過自身的快速生長繁殖,更快奪取營養(yǎng)物質(zhì)。在混合菌生物被膜中,某一微生物可通過弱化其他病原菌的粘附能力來增強自身粘附率[30]。Millezi等[31]通過對聚丙烯表面的大腸桿菌(Escherichiacoli)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的雙種生物被膜的研究發(fā)現(xiàn),雙菌種生物膜中的大腸桿菌降低了金黃色葡萄球菌的易感性,使得雙種生物膜中的金黃色葡萄球菌活細胞數(shù)量遠遠小于單種生物膜中金黃色葡萄球菌的活細胞數(shù)量。Wang等[32]發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)會明顯降低腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)的生長速率,對混合病原菌生物被膜中的腸道沙門氏菌有抑制作用。Rüger等[33]通過流式細胞術(shù)方法對銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)、洋蔥伯克霍爾德菌(Burkholderiacepacia)和金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)形成的混合菌生物被膜進行了研究,發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌在混合菌生物膜中的生長比其余兩株菌更具優(yōu)勢,這種優(yōu)勢是通過銅綠假單胞菌的拮抗性使得洋蔥伯克霍爾德菌和金黃色葡萄球菌的生長速率被抑制。Kuznetsova等[34]發(fā)現(xiàn),銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)通過分泌體外代謝產(chǎn)物來抑制大腸桿菌(Escherichiacoli)的生長繁殖,使得大腸桿菌在銅綠假單胞菌和大腸桿菌形成的混合菌生物被膜中的代謝率降低。Makovcova等[35]通過對金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸道沙門氏菌(Salmonellaenterica)、潛在致病性和非致病性大腸桿菌(Escherichiacoli)形成的單種和多種生物被膜生長率的研究可知,混合病原菌生物被膜中革蘭氏陰性菌比在單種生物被膜中生長的更好,但是混合菌生物被膜中的金黃色葡萄球菌菌群要明顯小于單種生物被膜中的金黃色葡萄球菌菌群?？偠灾?混合菌生物被膜內(nèi)的某一微生物會分泌可抑制其余微生物生長繁殖的代謝產(chǎn)物,或者利用自身生長優(yōu)勢掠奪營養(yǎng)物質(zhì)以弱化其它微生物的粘附力,從而在混合菌生物被膜中占據(jù)優(yōu)勢。

3 群體感應(yīng)機制

生物電化學(xué)系統(tǒng)(BESs)是用于電能生產(chǎn)、環(huán)境修復(fù)以及微生物代謝反應(yīng)的前沿技術(shù),其含有的化學(xué)活性微生物(EAMs)的電活性生物膜(EAB)可以通過各種電子傳遞方式與電極交換電子[36]。通常EAM通過三種方式向電極供電:地桿菌屬(Geobacteraceae)和希瓦氏菌屬(Shewanella)通過外膜細胞色素直接轉(zhuǎn)移電子;鐵呼吸菌屬(Ironrespiratoryfungus)是沿著模式生物體的導(dǎo)電菌毛直接傳輸電子;希瓦氏菌(Shewanella)釋放的抗體和由銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)產(chǎn)生的吩嗪通過自我合成的氧化還原介體間接轉(zhuǎn)移電子[37]。研究表明外部或內(nèi)源性群體感應(yīng)(QS)信號分子對電活性生物膜(EAB)有直接影響。

1994年Fuqua等[38]首次提出群體感應(yīng)概念,Alexander等[39]于1965年在肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)中發(fā)現(xiàn)了第一個群體感應(yīng)信號分子,至此群體感應(yīng)系統(tǒng)被提出。群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)是一種廣泛存在于微生物細胞間的通訊機制。微生物通過分泌和響應(yīng)特定的物理、化學(xué)信號分子來啟動細胞運動、化學(xué)生物合成和生物膜形成等行為[40]。QS可使細菌細胞間進行交流并協(xié)調(diào)他們的活動,因此,群體感應(yīng)在食源性混合病原菌生物被膜的建立和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用。

3.1 AHLs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)

N-酰基高絲氨酸內(nèi)酯類(AHLs)是革蘭氏陰性菌最常見的QS信號分子。當微生物處于指數(shù)生長期時,自體誘導(dǎo)物分子(AI-1)會通過細胞膜運輸至微生物細胞外進行介導(dǎo)[41]。Yeon等[42]發(fā)現(xiàn)了群體感應(yīng)淬滅現(xiàn)象,這種現(xiàn)象是因酰基轉(zhuǎn)移酶對高絲氨酸內(nèi)酯和AHL?；溨g的酰胺鍵造成不可逆地破壞,從而阻斷了信號通路。這一發(fā)現(xiàn)已被應(yīng)用于解決污水處理中的生物膜污染問題。

3.2 AIPs介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)

革蘭氏陽性細菌中主要存在的自誘導(dǎo)物是寡肽(AIPs),寡肽自誘導(dǎo)物是從前體細胞加工修飾所得。AIPs具有高度特異性,它通過激活DNA結(jié)合蛋白的方式來調(diào)控靶基因的轉(zhuǎn)錄。Quadri等[43]發(fā)現(xiàn),革蘭氏陽性細菌通常利用氨基酸和短肽來進行細胞間的基因調(diào)節(jié)。Miller等[44]進一步研究發(fā)現(xiàn),AIPs介導(dǎo)的群體感應(yīng)通常發(fā)生在微生物種內(nèi)或菌種之間,且寡肽自誘導(dǎo)物會使宿主發(fā)生特異反應(yīng)。

3.3 AI-2介導(dǎo)的群體感應(yīng)系統(tǒng)

自體誘導(dǎo)物分子AI-2首次被發(fā)現(xiàn)于哈氏弧菌屬中,Bassler等[45]發(fā)現(xiàn),哈氏弧菌中不僅存在AI-1信號分子,還存在另一種可進行種間交流的AI-2信號分子,它廣泛存在于革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌中,并可介導(dǎo)不同菌屬微生物間的相互交流。Ng等[46]證實,AI-2信號分子的合成與LuxS基因相關(guān),一旦LuxS基因失活,AI-2信號分子將不會產(chǎn)生。

4 結(jié)論與展望

食源性病原菌生物被膜的形成特性和抑制方法已經(jīng)受到食品領(lǐng)域?qū)＜业膹V泛關(guān)注,并已取得了較大進展,但目前對于混合病原菌生物被膜的研究較少。由于食源性混合病原菌形成的生物被膜結(jié)構(gòu)復(fù)雜且耐藥性更強,難以被抗生素等抑菌劑殺滅清除,因此,探究混合病原菌生物被膜的形成和相互作用機制尤為重要?；旌暇锉荒ぶ械募毦渫ǔＪ怯啥喾N類型的微生物群落組成,它們之間的相互協(xié)調(diào)作用和分泌胞外多糖的能力在底物交換、重要代謝產(chǎn)物的分布和代謝終產(chǎn)物的排泄中起著至關(guān)重要的作用。因此通過控制外部環(huán)境條件以及營養(yǎng)成分等因素可以改變微生物的產(chǎn)糖能力,從而控制混合病原菌生物被膜的形成。此外,混合菌生物被膜間存在群體感應(yīng)系統(tǒng),探究群體感應(yīng)信號分子的調(diào)控機制,是控制食源性混合病原菌生物被膜污染問題的突破口之一。