,明達, , ,成輝,,

(1.東北農(nóng)業(yè)大學食品學院,黑龍江哈爾濱 150030; 2.山東禹王生態(tài)食業(yè)有限公司,山東禹城 253000)

醬油是由大豆或豆粕等蛋白質(zhì)原料和面粉、小麥粉等淀粉質(zhì)原料,在曲霉等微生物產(chǎn)生的蛋白酶和淀粉酶等酶系作用下,經(jīng)過細菌、酵母菌等微生物的長期發(fā)酵,形成的富有多種氨基酸和糖類的色香味俱佳的調(diào)味品[1]。香氣是醬油風味的重要品質(zhì)特征,目前國內(nèi)外對醬油的揮發(fā)性香氣成分的檢測手段已經(jīng)十分成熟,熊芳媛等[2]通過用乙醚提取醬油香氣成分,氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分離鑒定其化學組成;王林祥等[3]采用同時蒸餾萃取法提取某高鹽稀態(tài)醬油的揮發(fā)性成分,用GC/MS分析香氣成分,共鑒定出種52種化合物;還可以通過電子鼻對氣味進行追蹤,但其識別精度不高。

頂空固相微萃取(HS-SPME)是一種集萃取、濃縮樣品中揮發(fā)性香氣成分的技術,具有操作簡便、快速,無需溶劑等優(yōu)點,已廣泛應用于諸如酒類、豆瓣醬和豆豉等發(fā)酵產(chǎn)品的揮發(fā)性香氣成分的檢測。目前通過頂空固相微萃取的方法分析醬油中的香氣成分的研究較為普遍:Meng等[4]在日式醬油中首次運用頂空固相微萃取鑒別出3種揮發(fā)性硫醇——糠基硫醇(咖啡香)、芐基硫醇(煙熏焦臭味)和2-巰基丙酸乙酯(熱帶果香)并證明這三種物質(zhì)是熱殺菌醬油中的典型香氣物質(zhì)。張艷芳等[5]利用固相微萃取的方法從低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油中分析鑒定出55 種揮發(fā)性風味成分,結果發(fā)現(xiàn)4-乙基愈創(chuàng)木酚低鹽固態(tài)醬油特有的重要香氣成分;Sun等[6]采用SPME-GC-MS技術對12種高鹽稀態(tài)法發(fā)酵的商業(yè)醬油中80種揮發(fā)性風味物質(zhì)進行分析,發(fā)現(xiàn)其共有香氣組分有34種,而主要香氣成分是醇類和酸類;張海珍等[7]人研究發(fā)現(xiàn)高鹽稀態(tài)發(fā)酵醬油中含有76種香氣組分,而低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油中含有62種香氣組分。綜上,可以發(fā)現(xiàn)低鹽固態(tài)發(fā)酵醬油由于發(fā)酵周期短,其香氣組分明顯少于高鹽稀態(tài)發(fā)酵的醬油。而基于醬油質(zhì)量和產(chǎn)率的考慮,工廠中通常在低鹽固態(tài)發(fā)酵的基礎上適當提高鹽含量,避免了較長的發(fā)酵周期,能夠明顯提高釀造醬油的風味,但對這種釀造工藝的研究未有報道。

本研究是通過運用頂空固相微萃取的方法對不同發(fā)酵時間段的醬油香氣成分進行分析,以期對醬油的香氣形成進行探究,并為提升傳統(tǒng)醬油的品質(zhì)提供理論依據(jù)和參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

醬油樣品 取自珍選公司。

2010-plus氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀 日本島津公司;手動進樣器、固相微萃取頭(75 μm CAR/PDMS) Supelco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 醬油的發(fā)酵工藝流程圖

圖1 醬油發(fā)酵工藝流程圖Fig.1 Soy sauce fermentation process

1.2.2 醬油樣品的采樣 從黑龍江省珍選公司發(fā)酵車間分別取發(fā)酵第5、10、20、30、42、50、59 d的醬油進行采樣,每個樣品(大約200 mL)封裝在不透明的塑料瓶中,并立即保存于-4 ℃冰箱中,以備分析。

1.2.3 萃取條件 參考鄧岳等[8]的方法,吸取醬油5 mL放入15 mL頂空進樣瓶中,加入磁力攪拌子,放在40 ℃水浴鍋中保持20 min,磁力攪拌速度200 r/min。用75 μm CAR/PDMS固相微萃取頭的手動進樣器對醬油樣品萃取,萃取溫度40 ℃,頂空吸附40 min。

1.2.4 揮發(fā)性物質(zhì)的GC-MS測定 采用TR-5ms彈性石英毛細色譜分析柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm),載氣為高純氦氣(1.0 mL/min),采用電子轟擊電離(EI)離子源,電子能量70 eV,電子倍增器電壓350 V,離子掃描范圍33～350 m/z,掃描速度3.00 scans/s,離子源溫度250 ℃,傳輸線溫度250 ℃。程序升溫條件(液體進樣):起始溫度60 ℃,保持2 min,以10 ℃/min 升至90 ℃,保持2 min,再以5 ℃/min升至130 ℃,保持2 min,再以10 ℃/min升至230 ℃,保持3 min。進樣量5 μL,不分流[9]。

通過計算機檢索,同時利用NIST 08和WILEY 09譜庫相互匹配進行定性分析。各組分相對含量按照峰面積歸一化法計算。

1.2.5 香氣活性值(OAVs) 香氣活性值(odor active values,OAVs)用于表征香氣成分的貢獻度[10],計算公式如下:

式中,A:某揮發(fā)性成分的質(zhì)量濃度,μg/L;B:該揮發(fā)性成分的閾值,μg/L。

1.2.6 主成分分析 選取樣品中香氣活性值大于1的揮發(fā)性香氣成分作為主要成分,進行主成分分析。從這些主要呈香物質(zhì)中提取出兩個主要成分,其累計貢獻率為100%,完全能代表呈香物質(zhì)的絕大部分信息[11]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

每個樣品重復檢測三次,檢測結果取平均值±標準差,采用SPSS 20.0 軟件的Duncan 多重檢驗及主成分分析進行數(shù)據(jù)處理及分析[12],圖表制作采用Origin 8.5軟件。

2 結果與分析

2.1 醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流色譜圖

通過運用頂空固相微萃取的方法對發(fā)酵時間分別為第5、10、20、30、42、50、59 d的醬油樣品進行測定,測定結果如圖2所示,可以看出醬油中的揮發(fā)性香氣物質(zhì)得到了很好的分離?？倱]發(fā)性物質(zhì)相對含量見表1，在整個發(fā)酵過程中,共統(tǒng)計了31種風味化合物,其中包括醇類3種,酸類4種,醛類4種,酯類6種,酚類4種,呋喃3種,其他化合物7種。醇類物質(zhì)為:1-辛烯-3-醇、苯乙醇、1,5-甲基-2-(1-甲基乙基)環(huán)己醇;酸類物質(zhì)為:乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸;醛類主要成分為:苯乙醛、壬醛、苯甲醛;酯類的主要成分為:1,2-苯二甲酸二異丁酯、苯乙酸乙酯;酚類為4-乙烯基愈創(chuàng)木酚、愈創(chuàng)木酚。

圖2 醬油HS-SPME氣相色譜-質(zhì)譜總離子流圖Fig.2 Total ion flow diagram of soy sauce HS-SPME gas chromatography-mass spectrometry

表1 總揮發(fā)性物質(zhì)的相對含量Table 1 Relative content of total volatile substances

通過對頂空固相微萃取所得到的香氣成分的含量和香氣活性值進行分類整理(表1)可以發(fā)現(xiàn):在醬油發(fā)酵過程中,除了醛類、酚類、酯類在發(fā)酵42 d后種類稍有減少,其他各類化合物種類總體保持增長的趨勢。在發(fā)酵前期,各類化合物的含量均呈現(xiàn)升高趨勢,到第42 d時,醇類、酯類、酚類的含量達到最大值,而在發(fā)酵后期,醇類、酸類、醛類、酚類則表現(xiàn)出下降的趨勢,這可能是由于部分物質(zhì)性質(zhì)活潑,與其他物質(zhì)結合生成新組分;呋喃類和其他類則保持持續(xù)增長。

香氣活性值是用于表征醬油重要呈味物質(zhì)的一個重要指標。通常認為OAVs 大于1 的化合物對醬油的風味有貢獻。由表1可知,香氣活性值>1的化合物共有4種,包括1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚,香氣活性值<1的化合物有8種,對香氣的形成也有一定的貢獻。

醬油中的醇類物質(zhì)主要是由糖和氨基酸的微生物發(fā)酵代謝產(chǎn)生的,實驗中檢測到的主要的醇類化合物包括1-辛烯-3-醇、苯乙醇、5-甲基-2-(1-甲基乙基)環(huán)己醇,其他的醇類化合物由于匹配值<80%而被忽略。在這三種化合物中,1-辛烯-3-醇和苯乙醇含量較高,并且1-辛烯-3-醇的平均香氣活性值達到4.6。1-辛烯-3-醇是米曲霉孢子的特征性揮發(fā)性成分,帶有一種蘑菇的香氣[16],而醬油的發(fā)酵過程中采用了米曲霉作為主要的發(fā)酵菌種,可以推測 1-辛烯-3-醇可能主要來源于大曲發(fā)酵階段。苯乙醇具有玫瑰的香氣,是酵母菌乙醇發(fā)酵降解苯丙氨酸的產(chǎn)物[17],在本次實驗中并未檢測到乙醇,原因可能是大部分的乙醇均被降解為苯乙醇[18]。

醬油中檢測到的酸類物質(zhì)有4種,分別為乙酸、2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸,在醬油生產(chǎn)過程中,乙酸是全部樣品中均檢出的物質(zhì),主要是由乳酸菌等繁衍代謝產(chǎn)生的,平均香氣活性值為2,對醬油香氣的貢獻很大,在很多發(fā)酵工藝中會通過添加酵母菌改善醬油風味[19-20]。而2-甲基丁酸、3-甲基丁酸、2-甲基丙酸均具有“奶酪香”的香氣特征。

醬油中醛、酮類物質(zhì)一般具有令人愉悅的香味,如甜香、草香、果香、焦香等,因此被認為是可以提高食品風味質(zhì)量的物質(zhì)。醬油中檢出的化合物以苯乙醛、壬醛、苯甲醛為主,且在所有醬油中均有檢出。苯乙醛的平均香氣活性值是1.5,具有濃郁的玉簪花香氣,是釀造醬油中的特征組分。這3個醛類能夠由氨基酸降解產(chǎn)生,因此其產(chǎn)生可能與發(fā)酵過程蛋白質(zhì)代謝有關系[21]。

醬油中酯類化合物是已報道物質(zhì)中品種最多的。大部分酯類物質(zhì)來源于發(fā)酵過程中醇與脂肪酸的酯化反應,在本次試驗中酯類化合物僅檢出6種——苯乙酸乙酯、軟脂酸乙酯、鄰苯二甲酸異丁酯、1,2-苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸異丁酯、2-甲基-丙酸 1-叔丁基-2-甲基-1,3-丙烷二基酯,這些組分是發(fā)酵過程的耐鹽酵母的主要代謝產(chǎn)物,賦予其悅人的“水果香”、“酯香”等[22]。

酚類和吡嗪類化合物是發(fā)酵豆制品中非常重要的化合物。本研究檢測出的4種酚類物質(zhì)都是醬油中常見的風味化合物,能貢獻煙熏香氣,其中4-乙烯基愈創(chuàng)木酚在所有樣品中均檢出,并且含量相對較高,平均香氣活性值達到3.4。這些酚類物質(zhì)常被認為與木質(zhì)素的代謝有關,有研究表明增加原料中小麥粉的比例能夠提高該類物質(zhì)的含量[23]。在很多研究中酚類物質(zhì)被認為是醬油醬香味的主要來源,雖然它們的含量不高,但是由于閾值較低,所以它們具有相對較高的氣味活度值,因此對于醬油濃郁的醬香味等風格特征具有決定性的作用[24],而吡嗪類化合物因為匹配度小于80%,未在本次實驗中未檢出。

呋喃化合物僅檢出3種,分別為3-苯基-呋喃、2-乙烯基-苯并呋喃2,5-二甲基-呋喃。然而曾經(jīng)被報道的重要呋喃類化合物如4-羥基-2-乙基-5-甲基-3-呋喃酮(HEMF)和4-羥基-2,5-二甲基-3-呋喃酮(HDMF)并未在此次實驗中檢測出,這可能與分析方法采用SPME有關系[25]。其他類物質(zhì)較多,但其氣味閾值尚未找到,其對香氣的貢獻度還有待研究。

2.2 重要香氣成分的主成分分析

對4種主要的香氣成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚進行主成分分析,得到了圖3中的主成分分析的得分圖和載荷圖。主成分1和主成分2的貢獻百分比為分別為57.824%和26.977%,根據(jù)得分圖,可以將不同發(fā)酵時間段的醬油樣品分為3簇,第一簇為第5、10、20 d的樣品,第二簇為第30 d的樣品,第三簇為第42、50、59 d的樣品。發(fā)酵前20 d,香氣成分緩慢積累,到第30 d時,出現(xiàn)較大的增長,而到發(fā)酵第42 d時,香氣成分的種類和含量都幾乎達到最大值,與發(fā)酵第50 d、第59 d的差別不大。根據(jù)載荷圖,對4種主要的香氣成分1-辛烯-3-醇,苯乙醛,乙酸,4-乙烯基愈創(chuàng)木酚進行主成分分析,從這4種主要呈香物質(zhì)中提取出兩個主要成分,其累計貢獻率為84.801%,能代表呈香物質(zhì)的絕大部分信息,發(fā)酵時間為 5、10、20、30 d的點落在第1象限,主要以具蘑菇香風味的1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征;發(fā)酵時間為 42、50、59 d的點落在第2 象限,與具玉簪花香氣的苯乙醛相對應。綜上,發(fā)酵時間為5～42 d時,主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征組分,而發(fā)酵時間為42～59 d時,主要以苯乙醛為特征組分。

圖3 主成分分析的得分圖(A)和載荷圖(B)Fig.3 Score map(A)and load map(b)of the principal component analysis

3 結論

通過運用頂空固相微萃取聯(lián)合氣質(zhì)的方法測定了珍選醬油釀造過程中多種揮發(fā)性香氣成分,研究發(fā)現(xiàn):這個發(fā)酵過程中共檢測出31種揮發(fā)性的香氣化合物,包括醇類3種,醛類4種,酸類4種,酯類6種,酚類4種,呋喃3種,其他化合物7種。醛類、酚類、酯類的種類和含量在發(fā)酵過程中呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢,在發(fā)酵第42 d達到最大值,其他各類化合物種類則總體保持增長的趨勢。通過測定其香氣活性值,確定了珍選醬油中主要的香氣物質(zhì)為1-辛烯-3-醇、苯乙醛、乙酸、4-乙烯基愈創(chuàng)木酚;在主成分分析中,發(fā)酵時間為5～42 d時,主要以1-辛烯-3-醇,乙酸及4-乙烯基愈創(chuàng)木酚為特征組分,而發(fā)酵時間為42～59 d時,主要以苯乙醛為特征組分。本文通過對珍選醬油釀造過程中揮發(fā)性香氣成分進行分析,不僅揭示了香氣成分的形成與發(fā)酵時間的關系,而且為快速提升傳統(tǒng)醬油的品質(zhì)提供理論依據(jù),具有實踐意義。